【摘要】： 目的 建立人胎兒角膜上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法,優(yōu)化人胎兒角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)體系,為構(gòu)建組織工程角膜提供上皮種子細(xì)胞。 方法 一、人胎兒角膜上皮原代和傳代培養(yǎng) 1、原代培養(yǎng) 嚴(yán)格無(wú)菌操作獲取人胎兒角膜片,采用組織塊貼壁法(角膜緣部、中央部)、酶消化法原代培養(yǎng)人胎兒角膜上皮細(xì)胞。 2、傳代培養(yǎng) 角膜緣部的細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%以上,不同稀釋濃度的胰酶/EDTA消化液消化傳代分別接種于空板、小鼠3T3成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層及HTK飼養(yǎng)層,培養(yǎng)液分別采用D/F12、小鼠3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液。 二、人胎兒角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的條件優(yōu)化 1、三種條件培養(yǎng)液蛋白含量測(cè)定與細(xì)胞增殖檢測(cè) 將收集的小鼠3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品的蛋白含量。 設(shè)D/F12為對(duì)照組,MTT法檢測(cè)3T3條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞系的增殖能力。 2、牛角膜細(xì)胞破碎液蛋白含量測(cè)定與細(xì)胞增殖檢測(cè) 將收集的牛角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞破碎液原液使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品的蛋白含量。設(shè)D/F12為對(duì)照組,MTT法檢測(cè)含5%、10%、20%不同濃度的三種牛角膜細(xì)胞破碎液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞系的增殖能力。 三、人胎兒角膜上皮細(xì)胞的性質(zhì)鑒定 將P3代人胎兒角膜上皮細(xì)胞用K3/12抗體進(jìn)行熒光染色,觀察傳代細(xì)胞是否還保持有角膜上皮細(xì)胞的特性。 收集P3代人胎兒角膜上皮細(xì)胞總RNA,用角膜基質(zhì)細(xì)胞作為陰性對(duì)照,檢測(cè)K12、Pax6、K15、ABCG2和P75在mRNA水平上的表達(dá)情況。 結(jié)果 一、人胎兒角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況觀察 1、原代培養(yǎng) 角膜緣部組織塊周圍遷出的細(xì)胞以圓形或卵圓形為主,排列緊密,生長(zhǎng)狀態(tài)良好;中央部的角膜上皮細(xì)胞體積大,以大而扁平的類表層上皮細(xì)胞為主,生長(zhǎng)狀態(tài)差;消化法培養(yǎng)可觀察到上皮消化成單細(xì)胞懸液,但接種后無(wú)細(xì)胞貼壁。 2、細(xì)胞傳代 觀察不同濃度消化液消化傳代的細(xì)胞發(fā)現(xiàn),采用0.05%胰酶+0.02%EDTA消化可觀察到消化后的細(xì)胞大部分成單細(xì)胞狀態(tài),傳代培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁及增殖良好。 接于HTK飼養(yǎng)層和胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層上的細(xì)胞不易貼壁且細(xì)胞不增殖,接于3T3飼養(yǎng)層上的細(xì)胞克隆生長(zhǎng),增殖能力強(qiáng),但繼續(xù)傳代后細(xì)胞老化,不再增殖,容易有角膜基質(zhì)細(xì)胞污染。 采用D/F12、HTK條件培養(yǎng)液及胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng),細(xì)胞增殖能力弱,逐漸老化,不能繼續(xù)傳代;采用3T3條件培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)3天后,可見(jiàn)形態(tài)規(guī)則的卵圓形小細(xì)胞集落分布于不規(guī)則的大細(xì)胞間,細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。傳至P4代胎兒角膜上皮細(xì)胞仍有較強(qiáng)增殖能力,但小細(xì)胞明顯減少。 二、人胎兒角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的條件優(yōu)化 1、三種條件培養(yǎng)液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞增殖的影響 用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)3T3條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定,結(jié)果顯示3T3條件培養(yǎng)液組蛋白含量最高。 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示3T3條件培養(yǎng)液可明顯促進(jìn)HCEC的增殖,其與胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液和D/F12三組差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、三種牛角膜細(xì)胞破碎液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞增殖的影響 用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)牛角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞破碎液液體進(jìn)行蛋白含量測(cè)定,結(jié)果顯示牛角膜上皮細(xì)胞破碎液為914μg/ml,牛角膜基質(zhì)細(xì)胞破碎液為953μg/ml,牛內(nèi)皮細(xì)胞破碎細(xì)胞液為1252μg/ml。 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示5%的牛上皮細(xì)胞破碎液、5%、10%�；|(zhì)細(xì)胞破碎液、10%牛內(nèi)皮細(xì)胞破碎液均可明顯促進(jìn)HCEC的增殖,四組與D/F12之間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,四組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、人胎兒角膜上皮細(xì)胞的性質(zhì)鑒定 1、免疫熒光染色可見(jiàn)P3代的人胎兒角膜上皮細(xì)胞K3/12染色陽(yáng)性。 2、RT-PCR檢測(cè)顯示,P3代人胎兒角膜上皮細(xì)胞在mRNA水平上有K12、K15、Pax6、P75和ABCG2的高表達(dá),而角膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較弱。 結(jié)論 一、組織塊貼壁法原代培養(yǎng)人胎兒角膜上皮細(xì)胞以及小鼠3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)方法基本建立; 二、人胎兒角膜緣部上皮細(xì)胞增殖能力優(yōu)于中央部; 三、3T3細(xì)胞條件培養(yǎng)液能促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增殖。
【圖文】：

圖5人胎兒角膜上皮細(xì)胞在3T3飼養(yǎng)層上傳代生長(zhǎng)情況a為P1代人胎兒角膜上皮細(xì)胞在3T3飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀態(tài):克隆團(tuán)不斷增殖，推擠飼養(yǎng)層細(xì)胞而匯合x100b為PZ代人胎兒角膜上皮細(xì)胞在3T3飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀態(tài):細(xì)胞增殖極緩，，細(xì)胞老化X100

圖5人胎兒角膜上皮細(xì)胞在3T3飼養(yǎng)層上傳代生長(zhǎng)情況a為P1代人胎兒角膜上皮細(xì)胞在3T3飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀態(tài):克隆團(tuán)不斷增殖，推擠飼養(yǎng)層細(xì)胞而匯合x100b為PZ代人胎兒角膜上皮細(xì)胞在3T3飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)狀態(tài):細(xì)胞增殖極緩，細(xì)胞老化X100
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2606430