【摘要】： 周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)作為一種重要的周期蛋白,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的預(yù)后密切相關(guān),并在多種腫瘤中存在著過(guò)度表達(dá)和活化。通過(guò)反義核酸、導(dǎo)入抗體和降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)CDK4蛋白均能阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖,因此CDK4被認(rèn)為是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。 胞內(nèi)抗體技術(shù)(intrcellular antibody or intrabody)通過(guò)基因重組技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗體分子,并被定位于特定的亞細(xì)胞器中,能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)靶分子,進(jìn)而影響靶分子的加工或分泌及其生物學(xué)效應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)特定基因表型敲除,成為一種新興的基因治療方法。但由于以往的研究中體外篩選的胞內(nèi)抗體在真核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下常出現(xiàn)不穩(wěn)定和可溶性降低等現(xiàn)象,抑制了其功能的有效發(fā)揮。胞內(nèi)抗體捕獲技術(shù)(intracellular antibodies capture technology, IACT)是一種在高通量篩選的基礎(chǔ)上,有效分離具有抗原特異性,并可在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定、可溶表達(dá)的胞內(nèi)抗體篩選技術(shù)。 為了制備高效抗CDK4胞內(nèi)抗體,有效的滅活腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)度活化的CDK4活性,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IACT方法將經(jīng)過(guò)兩輪CDK4抗原篩選富集的噬菌體單鏈抗體基因文庫(kù)同源重組或連接克隆至酵母表達(dá)載體中,獲得酵母人源單鏈抗體文庫(kù)。并通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)共篩選得到25個(gè)陽(yáng)性抗體克隆。 本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果對(duì)后續(xù)開(kāi)展抗CDK4胞內(nèi)抗體腫瘤基因治療的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

重組質(zhì)粒pGBKT7-CDK4的構(gòu)建流程

瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，在 T4 DNA 連接酶的作用下與載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行 EcoRI 和 SalI 酶切鑒定分析。瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，在7300 bp和910 bp處分別出現(xiàn)明顯的DNA條帶（圖3.2），與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本一致，初步確定 pGBKT7-CDK4 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步通過(guò) T 7 Promoter 和 T 7 Terminator 通用引物正反向測(cè)序 pGBKT7-CDK4 上的目的片段，測(cè)序結(jié)果表明，插入序列與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致，并且讀碼框完全正確，共 912bp，表達(dá) 303 個(gè)氨基酸，分子量大約 33.73 kD。3.1.2 pGBKT7-CDK4 的酵母轉(zhuǎn)化為了進(jìn)行后續(xù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)及其 IACT 篩選，首先將重組質(zhì)粒pGBKT7-CDK4 轉(zhuǎn)化酵母 Y187，涂布于 SD/-Trp 培養(yǎng)板上
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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1 孫應(yīng)飛,樊曉丹,李衍達(dá);真核基因剪接位點(diǎn)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征[J];清華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年03期

2 夏慧煜,李衍達(dá);真核基因選擇性剪接機(jī)理的初步研究[J];清華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年04期

3 薛國(guó)柱;呂勇剛;竇科峰;;噬菌體抗體庫(kù)篩選技術(shù)及在腫瘤研究中的應(yīng)用[J];腫瘤防治雜志;2005年23期

4 凌華,叢明,黃慧琴,呂家森,鮑時(shí)翔;RT-PCR克隆人血清白蛋白cDNA及其序列分析[J];熱帶作物學(xué)報(bào);2004年04期

5 蔡曉明;朱勇;;家蠶滯育卵浸酸解除滯育研究[J];四川蠶業(yè);2006年01期

6 吳靜;張平;周昌華;趙宗容;魏大鵬;章崇杰;;細(xì)胞因子受體-抗人AFP嵌合抗體融合蛋白的構(gòu)建及表達(dá)[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年05期

7 吳靜;張平;周昌華;趙宗容;魏大鵬;章崇杰;;細(xì)胞因子受體-嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];四川生理科學(xué)雜志;2008年03期

8 張國(guó)民;喬媛媛;陳宇萍;呂U，

本文編號(hào)：2583624