【摘要】： 第一部分Hfq參與鼠疫菌致病的分子調(diào)控機(jī)制研究 背景:鼠疫是一種自然疫源性疾病,其病原體是鼠疫耶爾森菌(以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)。鼠疫是一種人獸共患病,在自然界中主要以蚤類為傳播媒介寄居在特定的宿主(嚙齒動(dòng)物)內(nèi),引起鼠疫的周期性爆發(fā),通過(guò)偶然與患畜接觸或被帶菌跳蚤叮咬進(jìn)入人體,由皮下途徑感染,隨后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),在淋巴結(jié)部位引發(fā)腺鼠疫,如果未加控制,最后將發(fā)展成為致命的肺鼠疫和敗血癥鼠疫。在這個(gè)過(guò)程中,有多種機(jī)制幫助鼠疫菌完成蚤體內(nèi)生存、形成菌栓、在宿主體內(nèi)黏附、侵襲、抗吞噬以及宿主細(xì)胞毒性等功能。鼠疫菌傳播過(guò)程和多宿主生活周期,決定了鼠疫菌必須存在多種適應(yīng)宿主機(jī)制最終才能得以生存,并能在宿主間傳播以至最終致病。細(xì)菌中除了蛋白類的調(diào)控因子之外,還存在著一些發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼RNA(non-coding RNA),即調(diào)控sRNA(regulatory small RNA)。這些調(diào)節(jié)sRNA,它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后通常并不翻譯為蛋白質(zhì),廣泛存在于各種生物體中,在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。sRNA在轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止、mRNA穩(wěn)定性以及mRNA翻譯等環(huán)節(jié)上對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控,在染色體轉(zhuǎn)錄與失活、基因表達(dá)與關(guān)閉、細(xì)胞周期乃至個(gè)體發(fā)育等過(guò)程中均具有重要的作用,很可能對(duì)生物體的復(fù)雜性也起決定作用。其調(diào)節(jié)作用機(jī)制主要是利用序列互補(bǔ)或形成特定的“莖環(huán)結(jié)構(gòu)”(stem-loop)。在細(xì)菌中,sRNA和蛋白類調(diào)控因子緊密協(xié)同,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理過(guò)程來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的變化。蛋白協(xié)同因子在sRNA和其靶mRNA配對(duì)結(jié)合的過(guò)程中具有重要作用。細(xì)菌sRNA與靶RNA的配對(duì)大都需要RNA伴侶分子Hfq蛋白的參與。Hfq是一種RNA結(jié)合蛋白,被認(rèn)為是細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄后的關(guān)鍵調(diào)控因子。Hfq是高度保守的耐熱蛋白,在體內(nèi)通常形成環(huán)狀六聚體,與真核生物RNA剪接中的Sm和Sm樣蛋白同源。目前Hfq參與相關(guān)sRNA調(diào)控功能的研究已有很多,但Hfq在病原細(xì)菌中的作用及其相關(guān)機(jī)制仍不清楚。結(jié)合其他病原菌Hfq研究現(xiàn)狀和鼠疫菌自身特點(diǎn),我們推測(cè):鼠疫菌Hfq蛋白可能通過(guò)sRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,影響到鼠疫菌毒力基因的表達(dá)調(diào)節(jié),最終影響到鼠疫菌的致病過(guò)程。然而,尚未見(jiàn)到關(guān)于鼠疫菌Hfq蛋白與鼠疫菌致病相關(guān)的任何報(bào)道。本課題旨在探討鼠疫菌Hfq蛋白與鼠疫菌抗吞噬和致病的關(guān)系,并探討其可能的分子調(diào)控機(jī)制。 方法:采用基于λ-Red重組系統(tǒng)的基因突變技術(shù),以Km~R(卡那抗性盒)替代鼠疫菌hfq基因,構(gòu)建鼠疫菌?hfq缺失突變株( hfq::Km~R),并同時(shí)構(gòu)建其互補(bǔ)株(201Δhfq::Km~R/pACYC-hfq)。目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖是鼠疫菌感染機(jī)體早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而巨噬細(xì)胞涉及多個(gè)環(huán)境脅迫因素,如引發(fā)細(xì)菌熱休克反應(yīng)、過(guò)氧化物、高滲、抗菌肽和營(yíng)養(yǎng)缺乏等。根據(jù)上述鼠疫菌可能面臨的脅迫環(huán)境,我們確定了表型研究的主要內(nèi)容。利用體外生長(zhǎng)和存活實(shí)驗(yàn),比較上述對(duì)數(shù)中期的兩株菌對(duì)短期刺激(如熱、氧化脅迫)和長(zhǎng)期刺激(如高鹽、抗菌肽和營(yíng)養(yǎng)缺乏)的敏感性。Hfq蛋白很可能與鼠疫菌抗吞噬和細(xì)胞內(nèi)存活能力密切相關(guān),因此,我們?cè)O(shè)計(jì)細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這一想法。鼠疫菌感染鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1后,觀察鼠疫菌野生株和?hfq突變株侵染能力和引起巨噬細(xì)胞毒性的病理學(xué)變化,比較其吞噬率和不同時(shí)間存活率的差異。為研究Hfq在鼠疫菌毒力及致病性過(guò)程中的作用,我們比較野生株和突變株的毒力變化,鼠疫菌野生株和?hfq突變株以不同途徑(靜脈或皮下)感染BalB/c小鼠,最終計(jì)算半數(shù)致死劑量(LD50);鼠疫菌野生株和突變株等量混合后,大劑量靜脈感染小鼠,分析動(dòng)物體內(nèi)臟器的細(xì)菌分布情況,并計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)指數(shù)(competitive index, CI)。通過(guò)體外芯片轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行Hfq蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分析,體外培養(yǎng)鼠疫菌野生株和Δhfq突變株,分別提取總RNA,經(jīng)過(guò)雙色熒光(Cy3-或Cy5)標(biāo)記后,與鼠疫菌全基因組ORF芯片進(jìn)行雜交(芯片轉(zhuǎn)錄譜分析),比較野生株和突變株各個(gè)對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,在全基因組范圍內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)錄上調(diào)和下調(diào)的基因(轉(zhuǎn)錄后水平)。最后匯總上述所有數(shù)據(jù),探討Hfq參與鼠疫菌致病的分子機(jī)制。 結(jié)果:成功的構(gòu)建了鼠疫菌hfq突變株及其互補(bǔ)株。缺失hfq基因的鼠疫菌除生長(zhǎng)速度減慢外,對(duì)熱、氧化劑、抗菌肽和營(yíng)養(yǎng)缺乏的敏感性增加。缺失hfq基因后,鼠疫菌細(xì)胞相關(guān)細(xì)菌(cell-associated bacteria)沒(méi)有明顯改變,而吞噬率(phagocytosis percent)和早期存活率(survival percent)下降。缺失hfq基因的鼠疫菌毒力明顯下降,同時(shí)突變株在小鼠臟器內(nèi)的分布數(shù)量明顯下降,證明Hfq蛋白控制著鼠疫菌毒力和體內(nèi)生存力。缺失hfq基因引起了鼠疫菌243個(gè)共超過(guò)13類的基因轉(zhuǎn)錄水平變化。這些基因的功能涉及到小分子的降解,大分子的合成調(diào)控及降解、調(diào)控子、細(xì)胞被膜、致病性相關(guān)、轉(zhuǎn)運(yùn)/結(jié)合蛋白、能量代謝、質(zhì)粒源的蛋白等。其中56個(gè)基因(約23%)的基因可能參與鼠疫菌毒力或環(huán)境適應(yīng)反應(yīng)。 結(jié)論:Hfq在鼠疫菌對(duì)抗熱、氧化壓力、營(yíng)養(yǎng)缺乏以及抗菌肽的過(guò)程中有重要作用,但是在鼠疫菌對(duì)高鹽(高滲)的耐受中則不是必須的。提示Hfq可能參與鼠疫菌抵抗多種體外脅迫條件(熱、氧化應(yīng)激、抗菌肽、營(yíng)養(yǎng)缺乏等),這些體外條件與巨噬細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境吻合。因此,Hfq在鼠疫菌侵染巨噬細(xì)胞過(guò)程中可能起到重要作用。我們的細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí):Hfq蛋白可能與鼠疫菌抗吞噬和細(xì)胞內(nèi)存活能力密切相關(guān), Hfq可能通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá),調(diào)節(jié)鼠疫菌抗吞噬和胞內(nèi)存活特性。同時(shí)Hfq對(duì)于鼠疫菌致病性至關(guān)重要,對(duì)鼠疫菌的毒力以及在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程是必不可少的。?hfq突變株與野生株相比共有243個(gè)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化,其中有23%的基因可能與鼠疫菌應(yīng)激或毒力相關(guān)。這表明Hfq可能參與鼠疫菌多種生理及致病相關(guān)過(guò)程。匯總上述所有數(shù)據(jù)并總結(jié)現(xiàn)有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們提出了Hfq參與鼠疫菌致病可能的分子機(jī)制,即Hfq通過(guò)與sRNA相互作用,調(diào)節(jié)應(yīng)激蛋白和毒力因子的表達(dá),參與鼠疫菌的體外應(yīng)激、抗吞噬和致病過(guò)程。 第二部分KatA和KatY在鼠疫菌抗氧化過(guò)程中的作用及其調(diào)控研究 背景:鼠疫菌是鼠疫的病原菌,在其感染機(jī)體早期是一種兼性胞內(nèi)致病菌。鼠疫菌在蚤體內(nèi)和哺乳動(dòng)物體內(nèi)傳播,通過(guò)帶菌跳蚤的叮咬,或是與染菌動(dòng)物等接觸進(jìn)入人體。當(dāng)鼠疫菌進(jìn)入宿主后,首先被局部淋巴組織中的吞噬細(xì)胞(包括多形核白細(xì)胞PMNs和巨噬細(xì)胞)吞噬。單核細(xì)胞中的鼠疫菌被殺死,而被巨噬細(xì)胞吞噬的鼠疫菌則在巨噬細(xì)胞中可以存活和繁殖。吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫是在鼠疫釋放至細(xì)胞外之前主要的脅迫因素。所以,鼠疫菌可能具有嚴(yán)格的適應(yīng)抵御氧化壓力的機(jī)制以應(yīng)對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)的殺菌作用。鼠疫菌具有較高的氧化抗性,但其抗氧化機(jī)制目前還不清楚。KatY在鼠疫菌中作為一種溫度依賴性抗原被發(fā)現(xiàn)。假結(jié)核耶爾森菌中也有KatY在低鈣響應(yīng)中表達(dá),但是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)KatY的存在。根據(jù)基因組注釋信息,鼠疫菌的katA基因和katY基因都編碼過(guò)氧化氫酶/過(guò)氧化物酶。從芯片轉(zhuǎn)錄譜分析的結(jié)果看,上述兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄均受到體外低濃度H2O2的誘導(dǎo),katA和katY基因轉(zhuǎn)錄水平增加的倍數(shù)分別是2.5倍和3.2倍。結(jié)合OxyR的調(diào)控元分析,我們認(rèn)為上述兩個(gè)基因很可能是OxyR的靶標(biāo)基因。與此同時(shí),芯片雜交的結(jié)果還顯示,基因katA和katY均受溫度調(diào)控,但二者調(diào)節(jié)方向卻是相反的。鼠疫菌培養(yǎng)溫度由26°C上升到37°C時(shí),基因katY轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),而katA基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)。據(jù)此我們推測(cè)在不同培養(yǎng)溫度下的鼠疫菌對(duì)H2O2的敏感性可能不同。經(jīng)過(guò)序列比對(duì),確定KatY是一個(gè)過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶。katY基因與鼠疫菌編碼呼吸細(xì)胞色素的基因cybB及cybC相連,且其啟動(dòng)子共用一個(gè)pCD1編碼溫度感應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活子LcrF的一致識(shí)別序列。缺失pCD1質(zhì)粒的突變株中KatY的活性依然具有溫度依賴性,所以顯然KatY不僅受LcrF的調(diào)控。由于KatY具有分解巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的能力而且具有溫度依賴性,推測(cè)它是一個(gè)重要的毒力因子。但是仍然不清楚的是過(guò)氧化氫酶是如何參與鼠疫菌生理和致病過(guò)程的。本課題在研究KatA及KatY在鼠疫菌抗氧化機(jī)制中作用的同時(shí)進(jìn)行其調(diào)控因素的研究。研究鼠疫菌表達(dá)過(guò)氧化物酶/過(guò)氧化氫酶在鼠疫菌抗氧化過(guò)程的作用,及其調(diào)控因素,對(duì)于研究鼠疫菌抗氧化機(jī)制具有重要意義,為研究鼠疫菌胞內(nèi)存活機(jī)制提供依據(jù)。 方法:采用基于λ-Red重組系統(tǒng)的基因突變技術(shù),以抗性盒替代鼠疫菌katA、katY基因,構(gòu)建鼠疫菌ΔkatA、ΔkatY、ΔoxyR缺失突變株以及ΔoxyR-ΔkatA、ΔoxyR-ΔkatY雙突變株,并同時(shí)構(gòu)建其互補(bǔ)株。此外,構(gòu)建在無(wú)觸酶活性的大腸桿菌UM255株中的KatA和KatY蛋白表達(dá)菌株。通過(guò)凝膠染色實(shí)驗(yàn)以及過(guò)氧化氫酶/過(guò)氧化物酶活性直接測(cè)定來(lái)確定KatA和KatY的酶活性。隨后,利用H2O2抗性紙片實(shí)驗(yàn)研究KatA及KatY在鼠疫菌體外抗氧化過(guò)程中的作用。最后通過(guò)一系列不同條件下的lacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)研究katA和katY的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式,以及分子生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OxyR對(duì)katA和katY的調(diào)控。 結(jié)果:成功的構(gòu)建了ΔkatA、ΔkatY、ΔoxyR缺失突變株以及ΔkatA-ΔkatY、ΔoxyR-ΔkatA、ΔoxyR-ΔkatY雙突變株,及其互補(bǔ)株。成功表達(dá)并純化了KatA和KatY蛋白。凝膠染色實(shí)驗(yàn)以及過(guò)氧化氫酶/過(guò)氧化物酶活性直接測(cè)定顯示,KatA是一個(gè)單功能的過(guò)氧化氫酶,而KatY是過(guò)氧化氫酶/過(guò)氧化物酶。鼠疫菌的野生株在對(duì)數(shù)中期對(duì)H2O2具有高度抗性,與野生株相比在對(duì)數(shù)早期katY突變株對(duì)H2O2更加敏感。在對(duì)數(shù)中期, katY突變株與野生株對(duì)H2O2的抗性基本相同。鼠疫菌201野生株中β-半乳糖苷酶活性與?oxyR突變株相比,超過(guò)3倍,表明鼠疫菌OxyR可能由生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的外源過(guò)氧化氫刺激而激活。證明katA和katY均受OxyR的調(diào)控。與26°C相比,37°C時(shí)鼠疫菌katY基因轉(zhuǎn)錄水平增加,而katA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化,提示katY基因的轉(zhuǎn)錄受到溫度的調(diào)節(jié)。鼠疫菌oxyR突變株在26℃生長(zhǎng)時(shí)katA啟動(dòng)子活性在不同時(shí)期顯示出明顯的變化。在靜止期katA啟動(dòng)子活性最高。然而katY啟動(dòng)子活性在同樣的條件下并沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。被巨噬細(xì)胞吞噬后,與0時(shí)間點(diǎn)相比katY啟動(dòng)子的活性在5小時(shí)時(shí)增加約69倍,在2小時(shí)時(shí)增加約6倍。而katA啟動(dòng)子的表達(dá)則沒(méi)有這樣的變化。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OxyR與katA及katY基因啟動(dòng)子區(qū)均發(fā)生結(jié)合。DNase I足跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OxyR與katY轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游68-110bp以及katA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游151-186bp處結(jié)合。 結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鼠疫菌KatA和KatY的催化性質(zhì)與典型的過(guò)氧化氫酶相似。KatA是鼠疫菌在多種生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)的主要過(guò)氧化氫酶。結(jié)果說(shuō)明,KatA在鼠疫菌對(duì)抗過(guò)氧化氫刺激過(guò)程中具有主要的作用,與其他致病菌中對(duì)抗氧化殺傷的單功能過(guò)氧化氫酶相同。但是鼠疫菌KatY是一個(gè)雙功能過(guò)氧化氫酶,可能不再發(fā)揮傳統(tǒng)的生理作用。鼠疫菌KatA(HPII)和KatY(HPI)受過(guò)氧化反應(yīng)調(diào)控子OxyR的調(diào)控,而大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)中HPII則不受OxyR的調(diào)控。這說(shuō)明OxyR的功能即使在相似的腸道菌屬種也是不同的。但是OxyR在katA及katY中的DNA識(shí)別位點(diǎn)與大腸桿菌OxyR的DNA識(shí)別位點(diǎn)相似,說(shuō)明在不同的菌中OxyR的調(diào)控機(jī)制是相似的。?oxyR突變株katY基因轉(zhuǎn)錄顯示出溫度依賴性表達(dá),而KatA受到生長(zhǎng)時(shí)期調(diào)控。KatA和KatY的調(diào)控應(yīng)進(jìn)一步研究。Garcia提出,LcrF不是KatY溫度調(diào)控的唯一調(diào)控子。已知的RNA溫度調(diào)控子位于特定的熱休克或是毒力基因5’-非翻譯區(qū),通過(guò)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的溫度依賴性堿基配對(duì)結(jié)合來(lái)調(diào)控翻譯。katY的5’-非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)預(yù)測(cè)顯示出具有ROSE樣RNA溫度計(jì)(RNA thermometer)相關(guān)性質(zhì)。可能的RNA溫度計(jì)是否對(duì)調(diào)控KatY翻譯應(yīng)進(jìn)一步研究。鼠疫菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)可以存活并增殖。鼠疫菌與宿主巨噬細(xì)胞件的相互作用可能是其致病性的關(guān)鍵。KatY受到溫度及過(guò)氧化氫的調(diào)控,這是吞噬溶酶體內(nèi)微環(huán)境的兩個(gè)主要部分。細(xì)菌在胞內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)KatY的水平升高,這說(shuō)明鼠疫菌KatY可能在感染過(guò)程中巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活及生長(zhǎng)中具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R516.8;R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 巨立中,成軍,鐘彥偉;啟動(dòng)子DNA結(jié)合蛋白研究策略[J];世界華人消化雜志;2004年01期

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本文編號(hào)：2574035