【摘要】： 背景腫瘤、創(chuàng)傷、炎癥、代謝異常等造成的軟骨損傷和退變是骨科臨床上常見且尚不能有效解決的難題之一。組織工程技術的發(fā)展為軟骨缺損的修復帶來了希望,成為研究熱點,作為種子細胞的骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能和自身強大增殖更新能力更被廣泛研究。但軟骨分化的誘導方法有待進一步的研究改進,分化調控及損傷修復的機制仍不是很清楚。microRNAs(miRNAs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個核苷酸的非編碼RNAs分子。研究表明,它在干細胞的增殖、分化發(fā)育過程通過轉錄后基因調控發(fā)揮著重要作用,也有可能參與BMSCs體內外分化為軟骨細胞的調控以及軟骨發(fā)育、成熟及生物學特性的維持。本實驗室前期研究中通過miRNAs基因芯片已獲取BMSCs及其誘導分化的軟骨細胞的差異性miRNAs表達譜。 目的本課題在人骨髓間充質干細胞(BMSCs)及其誘導分化的軟骨細胞中miRNA基因的差異表達譜的基礎上進一步篩選和驗證出軟骨分化相關調控作用的miRNAs并研究其生物學功能,為進一步闡明miRNA在BMSCs軟骨分化過程中的作用和意義提供實驗基礎。 方法(1)利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法自人骨髓中分離BMSCs,在體外擴增傳代培養(yǎng),通過對其形態(tài)特點的觀察、細胞表面標志物檢測及多向誘導分化,對培養(yǎng)的人BMSCs進行鑒定。(2)采用體外單層培養(yǎng)方法,經(jīng)含有TGF-β1、胰島素、地塞米松、轉鐵蛋白、維生素C和牛血清白蛋白的軟骨誘導培養(yǎng)液誘導21天,通過HE染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色對誘導分化的軟骨細胞進行鑒定。(3)在人BMSCs及其誘導分化的軟骨細胞miRNAs的差異表達譜的基礎上,采用生物信息學分析及實時定量PCR進一步篩選和驗證差異表達的miRNA基因。(4)轉染miR-26b的模擬物及阻遏物至人BMSCs中,培養(yǎng)21天后,通過HE染色、甲苯胺藍、免疫組織化學染色對轉染后的實驗組及對照組進行鑒定。 結果(1)經(jīng)骨髓分離培養(yǎng)所得到的細胞符合骨髓間充質干細胞特征,流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD29、CD44為陽性,CD34、CD45為陰性,細胞周期僅有13.1%細胞處于活躍增殖期,體外經(jīng)誘導可分化為成骨細胞及脂肪細胞。(2)人BMSCs經(jīng)含TGF-β1、胰島素、地塞米松、轉鐵蛋白、維生素C和牛血清白蛋白的G-DMEM培養(yǎng)基誘導21天后,HE染色、甲苯胺藍、免疫組織化學染色均陽性,符合軟骨細胞的特征。(3)篩選并驗證了4個與軟骨分化相關的miRNAs,miR-26b,miR-28,miR-130b,miR-152,這些miRNAs在軟骨分化過程中表達增高。(4)轉染miRNA-26b模擬物能促進人BMSCs向軟骨細胞分化,轉染miRNA-26b阻礙物后繼續(xù)加入軟骨誘導液培養(yǎng)時BMSCs仍可向軟骨細胞分化。 結論綜上所述,我們通過實驗發(fā)現(xiàn)了:(1)用全骨髓貼壁生長法可以從骨髓中分離得到人BMSCs,并可在體外將其誘導分化為軟骨細胞。(2)在人BMSCs及其軟骨誘導分化過程中存在表達差異的miRNAs,這些差異性的miRNAs可能對人BMSCs的軟骨誘導分化起著一定的調控作用,其作用受體內外多種環(huán)境因素的影響。(3)miRNA-26b在人BMSCs體外軟骨分化中發(fā)揮促進的作用。
【圖文】：

編碼基因在不同物種的進化中具有高度的保守性，部分基因成簇，且常常協(xié)同表達，具有共同的調控功能。④ miRNAs作用靶點：多為轉錄或凋亡調控基因的完全或不完全配對的3’UTR的堿基對。1.2 miRNA的生成、作用機制和研究方法miRNA的生成經(jīng)由細胞核和細胞質中兩個過程完成[9]。在核內編碼miRNA的基因在RNA pol-Ⅱ的作用下轉錄成長度數(shù)百個nt的前體轉錄本(pri-miRNA) ，隨后被 Drosha 酶加工形成約 60nt 的發(fā)夾結構的莖環(huán)前體( pre-miRNA)。它與雙鏈RNA結合蛋白形成微處理體并隨后由Ran-GTP及其受體Exportin-5轉運出核，并由胞漿中的Dicer酶加工成約22nt的雙螺旋鏈miRNA分子，其中成熟的miRNA被選擇性地裝配進特異RNA誘導沉默復合體（RISC）中發(fā)揮作用，互補鏈立即被降解。(見圖1)

編碼基因在不同物種的進化中具有高度的保守性，部分基因成簇，且常常協(xié)同表達，，具有共同的調控功能。④ miRNAs作用靶點：多為轉錄或凋亡調控基因的完全或不完全配對的3’UTR的堿基對。1.2 miRNA的生成、作用機制和研究方法miRNA的生成經(jīng)由細胞核和細胞質中兩個過程完成[9]。在核內編碼miRNA的基因在RNA pol-Ⅱ的作用下轉錄成長度數(shù)百個nt的前體轉錄本(pri-miRNA) ，隨后被 Drosha 酶加工形成約 60nt 的發(fā)夾結構的莖環(huán)前體( pre-miRNA)。它與雙鏈RNA結合蛋白形成微處理體并隨后由Ran-GTP及其受體Exportin-5轉運出核，并由胞漿中的Dicer酶加工成約22nt的雙螺旋鏈miRNA分子，其中成熟的miRNA被選擇性地裝配進特異RNA誘導沉默復合體（RISC）中發(fā)揮作用，互補鏈立即被降解。(見圖1)
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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