【摘要】： 近年來,國際上逐步發(fā)展起了一種新的基因疫苗載體系統(tǒng),稱為復(fù)制型DNA疫苗,克服了常規(guī)DNA疫苗免疫力低下、安全方面不能保障的缺陷,同時(shí)又保留了DNA疫苗穩(wěn)定、低成本的優(yōu)點(diǎn),因而成為開發(fā)治療性疫苗最好的技術(shù)途徑之一。 本研究室前期自主開發(fā)了基于塞姆利基森林病毒SFV的復(fù)制子DNA疫苗載體系統(tǒng)(可復(fù)制型DNA疫苗),并用于腫瘤疫苗及乙肝疫苗等新型治療性基因疫苗的研究。所謂可復(fù)制型DNA疫苗,是在RNA復(fù)制子疫苗基礎(chǔ)上發(fā)展演化而來的一種新型DNA疫苗系統(tǒng)。與常規(guī)DNA疫苗相比,可復(fù)制型DNA疫苗利用RNA復(fù)制酶,在細(xì)胞中具有自我復(fù)制能力,介導(dǎo)RNA復(fù)制子在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行大量自我復(fù)制,因此外源基因可以得到高效表達(dá)。同時(shí)RNA大量自我復(fù)制過程中,產(chǎn)生的雙鏈RNA是強(qiáng)效天然免疫佐劑,使可復(fù)制型DNA疫苗免疫效力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)DNA疫苗,用量可降低到傳統(tǒng)DNA疫苗的100倍以下。再有,該疫苗的自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)均發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中,最終會誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡,從而消除了與宿主細(xì)胞基因組整合的危險(xiǎn)性,大大提高了基因疫苗的安全性。而且,這種疫苗以類似脈沖的形式刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),能夠有效克服免疫耐受。 為了進(jìn)一步提高復(fù)制子DNA疫苗抗原的遞送效率和免疫效果,本研究將復(fù)制子載體包裝成為甲病毒顆粒樣疫苗,同時(shí)還對所制備顆粒進(jìn)行DC靶向化改造。病毒顆粒這種疫苗形式,除了具備復(fù)制子疫苗的全部優(yōu)點(diǎn)外,還可以使其包裝的復(fù)制子DNA免受核酸酶的降解,增強(qiáng)抗原進(jìn)入細(xì)胞的效率,充分發(fā)揮病毒樣顆粒本身的免疫學(xué)特性。同時(shí),通過對這種重組的甲病毒顆粒疫苗進(jìn)行DC靶向化改造,在體內(nèi)選擇性感染DC細(xì)胞,進(jìn)一步增強(qiáng)DC細(xì)胞對抗原的吞噬、加工和遞呈功能,從而提高疫苗激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的效果,最終提高疫苗的免疫效力。 首先,本研究以基于SFV的含有紅綠熒光蛋白報(bào)告基因的復(fù)制子DNA表達(dá)載體pSCK-EGFP-IRES-dsRED為基礎(chǔ),通過與輔助載體pSHCAR共轉(zhuǎn)染,由pSHCAR提供結(jié)構(gòu)蛋白,制備表達(dá)紅綠熒光蛋白報(bào)告基因的重組病毒顆粒,并驗(yàn)證其表達(dá)能力。同時(shí),通過實(shí)驗(yàn),比較單獨(dú)pSCK-EGFP-IRES-dsRED質(zhì)粒和所制備的含有紅綠熒光蛋白報(bào)告基因的重組病毒顆粒的表達(dá)能力。通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染時(shí)復(fù)制子表達(dá)載體和輔助載體的比例,并計(jì)算病毒滴度,初步摸索甲病毒包裝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)情況初步可以看出重組病毒顆粒表達(dá)效率比單獨(dú)轉(zhuǎn)染pSCK-EGFP-IRES-dsRED質(zhì)粒要高,所制備的重組病毒滴度能夠達(dá)到6.5×105IU/mL。通過對比在共轉(zhuǎn)染時(shí)復(fù)制子DNA表達(dá)載體和輔助載體的摩爾比為1:1或者是質(zhì)量比為1:1,經(jīng)過檢測紅綠熒光蛋白報(bào)告基因,得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是:共轉(zhuǎn)染時(shí)可復(fù)制型DNA表達(dá)載體和輔助載體的質(zhì)量比為1:1時(shí),能得到更高滴度的病毒顆粒。 在上述研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對本室前期構(gòu)建的HBV復(fù)制子DNA疫苗pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7進(jìn)行病毒樣顆�；b研究。將pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7質(zhì)粒與輔助載體共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,制備HBV復(fù)制子病毒顆粒疫苗,并通過流式細(xì)胞儀和免疫熒光檢測HBV復(fù)制子病毒顆粒疫苗的表達(dá)能力。初步結(jié)果可以看出,HBV復(fù)制子病毒顆粒疫苗能夠在細(xì)胞中表達(dá),經(jīng)病毒滴度測定,制備的重組病毒滴度達(dá)到1.5×105 IU /mL。 然后,我們借鑒國外的最新研究,以基于SFV(塞姆利基森林病毒)的可復(fù)制型病毒顆粒疫苗為基礎(chǔ),對其進(jìn)行DCs靶向化研究。主要工作就是對基于SFV的輔助載體pSHCAR進(jìn)行DC靶向化改造,使其輔助包裝的病毒顆粒能特異性地結(jié)合DC表面分子DC-SIGN,從而實(shí)現(xiàn)病毒顆粒疫苗對DC細(xì)胞的特異性感染,進(jìn)一步提高抗原遞呈效率。最后對改造后的輔助載體進(jìn)行表達(dá)和包裝能力的初步驗(yàn)證。初步結(jié)果證實(shí):改造后的輔助載體pSHCART具有較好的表達(dá)能力,通過RT-PCR檢測手段證明改造后的輔助載體具有包裝并形成病毒的能力,并且通過與復(fù)制子表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染能提高復(fù)制子表達(dá)載體的表達(dá)率。 為了進(jìn)行重組甲病毒顆粒體外DC靶向化實(shí)驗(yàn)研究,本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN分子的BHK21細(xì)胞系。通過構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES-neo-DC-SIGN,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,以G418進(jìn)行陽性克隆的篩選,通過有限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN分子的BHK21細(xì)胞系,利用流式細(xì)胞儀、Western印跡及免疫熒光法檢測DC-SIGN分子的表達(dá),最終成功構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)人DC-SIGN分子的BHK21細(xì)胞系,為接下來DC靶向化重組甲病毒顆粒體外實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 該DC靶向可復(fù)制型甲病毒顆粒疫苗載體系統(tǒng)的最終研究成功,將在“顆�；�、內(nèi)源化、高效化、靶向化”遞呈抗原方面,具有不可比擬的技術(shù)優(yōu)勢。其應(yīng)用價(jià)值和潛力,有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
【圖文】：

第一部分 基于可復(fù)制型甲病毒顆粒的 HBV 疫苗制備2 含有報(bào)告基因的重組病毒感染細(xì)胞后的流式細(xì)胞儀及免疫熒光分析結(jié)果重組病毒感染 24h 后的 BHK21 細(xì)胞，pSCK-EGFP-IRES-dsRED 表達(dá)紅綠熒光蛋白報(bào)告基因，收集細(xì)胞直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，流式檢測后將細(xì)胞滴片進(jìn)行免疫熒光檢測，重組病毒的表達(dá)效率為 28.03%，參見圖 1.2 所示。

一部分 基于可復(fù)制型甲病毒顆粒的 HBV 疫苗重組病毒滴度的初步確定和重組病毒不同條件下生產(chǎn)的效率1 重組病毒滴度的測定結(jié)果為了測得所制備的重組病毒的滴度，根據(jù)紅綠熒光蛋白報(bào)告基因計(jì)數(shù)法進(jìn)度測定，初步確定制備的重組病毒的滴度。經(jīng)過計(jì)算不同比例稀釋的重組病清感染細(xì)胞后的表達(dá)效率，重組病毒共表達(dá)紅綠熒光蛋白的效率分別.03%、11.42%和 1.19%，，分別計(jì)算病毒的滴度，然后取其平均值，計(jì)算出所的表達(dá)紅綠熒光蛋白報(bào)告基因的病毒滴度為 6.5×105IU/mL。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：2548063