【摘要】： 目的 1.建立間接包被ELISA (enzyme linked immunosorbent assy,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測血清游離β-HCG (free-β-huaman chorionic gonadotropin,F-β-HCG)檢測方法。 2.探討降低ELISA試驗(yàn)中非特異反應(yīng)的方法。 3.評估游離β-HCG檢測在相關(guān)疾病診療中的意義。 方法 1.間接包被ELISA法檢測血清游離β-HCG方法學(xué)建立(1)BBC酶標(biāo)反應(yīng)板的制備,(2)抗游離β-HCG單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)的生物素化, (3)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)過碘酸鈉法標(biāo)記抗游離β-HCG多克隆抗體(polyclonal antibody, pAb),(4)間接包被ELISA法檢測血清游離β-HCG方法學(xué)建立及評價(jià)。 2.降低ELISA中非特異顯色方法學(xué)探討(1)更換標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,(2)用連接有包被抗體的親和層析柱提純酶標(biāo)抗體,(3)在酶標(biāo)抗體中加入包被抗體的Fc段3.血清游離β-HCG與相關(guān)疾病的臨床研究(1)血清游離β-HCG檢測對正常妊娠與異位妊娠的診斷意義,(2)血清游離β-HCG檢測在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的臨床意義。 結(jié)果 1.間接包被ELISA法檢測血清游離β-HCG方法學(xué)建立：通過對該方法中各種反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定了最適工作條件：生物素抗體和酶標(biāo)抗體的最適工作濃度分別為1：1000和1：12000,本檢測方法具有較好的穩(wěn)定性,靈敏度0.1ng/ml,回收率95.92%～102.51%,批內(nèi)差異7.54%～11.12%,批間差異12.51%～18.11%,與FSH、TSH、LH、α-HCG的交叉反應(yīng)率0.1%,檢測范圍0.1～500ng/ml,與進(jìn)口試劑盒的相關(guān)性尚可(r2=0.7892)。 2.降低ELISA中非特異顯色方法學(xué)探討：結(jié)果顯示,更換標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和用連接有包被抗體的親和層析柱提純酶標(biāo)抗體兩種方式對本方法不適用,而向酶標(biāo)抗體中加入包被抗體的Fc段在本實(shí)驗(yàn)中效果顯著。 3.血清游離β-HCG與相關(guān)疾病的臨床研究：正常妊娠孕婦血清游離β-HCG水平明顯高于異位妊娠患者(p0.05),妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者血清游離β-HCG水平明顯高于正常妊娠孕婦(p0.05)。 結(jié)論 1.本文研制的間接包被檢測血清游離β-HCG方法,引入了生物素-親合素系統(tǒng),提高了抗體利用率,在很大程度上降低了“鉤狀效應(yīng)”的產(chǎn)生,且靈敏度高、特異性好,具有較好的穩(wěn)定性和檢測范圍,適于臨床應(yīng)用。 2.本文探討了三種降低ELISA中非特異顯色的方法,均具有一定的應(yīng)用價(jià)值,尤其在酶標(biāo)抗體中加入包被抗體的Fc段的方法,目前國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。 3.血清游離β-HCG的測定為異位妊娠、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病等的診斷提供重要依據(jù)。
【圖文】：

ProtainA純化抗F一p一HCGmab

1.1.2.3酶標(biāo)抗體的標(biāo)記1.1.2.3.1實(shí)驗(yàn)原理:經(jīng)典的過碘酸鈉(NaIO4)法，需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的a和。氨基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來wilson等改用在低pH下使用NaIO4活化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP的步驟。HRP經(jīng)NalO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH‘(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)一記抗體。酶與抗體結(jié)合后，根據(jù)分子篩原理，可用SePhadexGZoo凝膠將酶結(jié)合物與游離的酶及抗體分開。1.1.2.3.2實(shí)驗(yàn)方法(l)HRp的活化:稱取20mg的HRP，溶于1omM(pH7.4)的醋酸鈉溶液中，終濃度為Zomg/ml。在酶中加入17oulo.ZM的Nalo4，邊加邊攪拌，室溫避光反應(yīng)15min。再加入0.sml乙二醇，室溫避光攪拌smin，以終止反應(yīng)。(2)HRp的脫鹽:將SephadexG25凝膠預(yù)處理后裝柱。用10倍體積0.3M的pHg.5碳酸鹽緩沖液平衡柱體。將處理過的HRP上樣，收集洗脫液顏色最深的部分(圖2)，，此過程主要目的為脫鹽。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2545972