發(fā)布時間：2019-10-07 23:02

【摘要】： 研究背景：組織工程血管以及組織工程化組織的血管化因目前內(nèi)皮種子細(xì)胞擴增能力和生物活力的不足而受到限制。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。并可被轉(zhuǎn)移至外周血,參與缺血組織的血管重建和血管的內(nèi)膜化,因此EPCs有望成為今后組織工程內(nèi)皮種子細(xì)胞的重要來源。為此,有關(guān)EPCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴增和細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控亟待深入研究,在細(xì)胞行為調(diào)控中,鈣離子是細(xì)胞生物行為的重要調(diào)控因子,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡時,會導(dǎo)致多種細(xì)胞異常行為發(fā)生,從而引發(fā)疾病。鈣離子載體A23187是一種高度選擇性的鈣離子載體,能與Ca2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物,使胞外的Ca2+透過細(xì)胞膜,生理性或人為性地提高胞漿游離鈣水平,有效增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,增高的Ca2+作為第二信使可促使蛋白激酶C(PKC)和其他鈣依賴性蛋白激酶活化,并催化細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化,從而啟動淋巴細(xì)胞活化、增殖。此外,A23187還是氧化磷酸化的解偶聯(lián)體,抑制線粒體ATP酶的活性,影響細(xì)胞代謝水平。 研究目的第一部分研究目的在于建立體外培養(yǎng)臍血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)體系,包括臍帶血采集、單個核細(xì)胞分離、內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞生長特性和表型分析鑒定。第二部分研究目的在于利用移動性鈣離子載體A23187作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察其對內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用影響；以表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhanced laser desorption／ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術(shù)分析A23187作用后的內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及其對細(xì)胞表型和細(xì)胞蛋白質(zhì)表達譜的影響,探討不同濃度A23187及引起的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化對內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控機制和作用,為內(nèi)皮祖細(xì)胞調(diào)控機制和臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。 研究方法在第一部分中,經(jīng)無菌采集后的臍帶血,在2小時內(nèi)經(jīng)密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞,以本室已建立的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng),從臍血獲得的單個核細(xì)胞接種4天后,分別選取貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞進行培養(yǎng)至第12天后,觀察兩種方法所獲得細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量。對懸浮細(xì)胞進行培養(yǎng),免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)7天后的細(xì)胞進行內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞表型CD34、CD133、vWF、CD146,CD144鑒定,培養(yǎng)過程中,觀察細(xì)胞生長狀況并測定細(xì)胞生長曲線。在第二部分中,鈣離子載體A23187以0,1,3,5μmol／L作用于培養(yǎng)至第七天的內(nèi)皮祖細(xì)胞,作用24小時,后流式細(xì)胞術(shù)檢測A23187不同濃度作用下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,并且利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度A23187作用下P1H12 (CD146)的表達量。采用SELDI蛋白質(zhì)芯片檢測不同A23187濃度作用下蛋白質(zhì)差異表達情況：1.Western-IP裂解液進行蛋白質(zhì)提取并利用BCA法測定蛋白濃度；2.蛋白活化點樣；3.芯片檢測；4.數(shù)據(jù)處理與分析。 研究結(jié)果第一部分中,經(jīng)觀察篩選,發(fā)現(xiàn)從臍血獲得的單個核細(xì)胞接種4天后,分別選取貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞進行培養(yǎng)至第12天后,觀察兩種方法所獲得細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量。發(fā)現(xiàn)選取貼壁細(xì)胞進行培養(yǎng),細(xì)胞總數(shù)較少為301±205,并且無梭形樣內(nèi)皮祖細(xì)胞出現(xiàn)；相反,選取懸浮細(xì)胞進行培養(yǎng),至第12天時,細(xì)胞數(shù)量達708±142(P0.05),并且出現(xiàn)梭形樣內(nèi)皮祖細(xì)胞。故此,本研究選用懸浮細(xì)胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng),其接種后前5天為生長的潛伏期,細(xì)胞開始貼壁,無明顯擴增。第6天平均每個視野下細(xì)胞數(shù)目為287±45；第9天細(xì)胞數(shù)為282±46；第12天開始,細(xì)胞進入對數(shù)生長期,細(xì)胞數(shù)為805±67(P0.05,與第6天的細(xì)胞相比)；第19天細(xì)胞繼續(xù)增殖,細(xì)胞數(shù)為1115±182(P0.05,與第6天的細(xì)胞相比)；第23天時,細(xì)胞進入凋亡期,數(shù)量明顯減少,為265±61(P0.05,與第6天的細(xì)胞相比)。vWF,CD146,CD144表達陽性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,梭形樣細(xì)胞群體中,CD34陽性率為88.98%±5.15%(P0.05),CD133陽性率為1.20%±1.44%(P0.05)。第二部分中,經(jīng)SELDI技術(shù)檢測A23187不同濃度組,結(jié)果顯示共有20個差異表達蛋白,其中12個高表達,8個為低表達(P0.05)。并且內(nèi)皮祖細(xì)胞CD146陽性率呈A23187濃度依賴性降低,并發(fā)現(xiàn)鈣離子載體A23187在濃度高至10μmol／L時,有顯著促進內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡作用。 研究結(jié)論經(jīng)本研究建立的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系,能夠自臍帶血來源的單個核細(xì)胞成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出具內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞表型鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞。對上述內(nèi)皮祖細(xì)胞以鈣離子載體A23187作用,發(fā)現(xiàn)A23187在低濃度時,抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化；高濃度時,凋亡細(xì)胞數(shù)目增加,有濃度依賴性促進內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡,并且具有抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用。 待研究工作：對本研究中以SELDI技術(shù)檢出的差異蛋白質(zhì)點進行進一步分析,采用二維凝膠電泳及質(zhì)譜法對于差異表達蛋白進行鑒定。
【圖文】：

圖2臍帶血單個核細(xì)胞所獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞(IOX20)Fig.2EPCsfromumbiliealeordbloodmononucleareellsNote:AEPCseoloniesappearedatdays;BTherearethreedifferenimorphtyPesofcellsatday6:CThenumberofeobblestone一likeeellsincreasedatDNoeellapoPtosisbefoundatday19;EThenurnberofeellsbeeamede(10X20).2.3細(xì)胞生長曲線測定人臍血源性內(nèi)皮祖細(xì)胞原代培養(yǎng)生長曲線顯示，細(xì)胞在接種后前5天為細(xì)胞逐漸開始貼壁，無明顯擴增;12天以后，細(xì)胞進入對數(shù)生長期，此時細(xì)活躍;培養(yǎng)至第19天時，細(xì)胞數(shù)目最多;到23天后，進入衰退期，細(xì)胞開數(shù)目減少，如表2。表2細(xì)胞生長情況Tab1e2GrowingstatesofEPCs(對‘，，n=3)

B圖2.A23187不同濃度干預(yù)下，CD146細(xì)胞陽性率A.不同濃度A23187作用下細(xì)胞散點圖;B.不同濃度A23187作用下CD146細(xì)胞陽性率2.3SELDI檢測不同濃度A23187干預(yù)下EPc蛋白表達的變化2.3.1四組均檢測出較多的蛋白質(zhì)峰各組樣本蛋白質(zhì)芯片檢測用BiomarkerWizard軟件對所有蛋白質(zhì)進行標(biāo)準(zhǔn)化后，以減少不同芯片、儀器狀態(tài)波動等因素引起的實驗誤差。每例樣本在質(zhì)荷比2.0一300kD均能檢測出222個蛋白峰。2.3.2各組間蛋白差異表達明顯的峰與對照組相比，1，3，5uMA23187作用的EPCS檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)共有20個蛋白差異表達明顯的峰。其中，高表達的有12個，低表達的有8個(表2)，(P<0.05)。表2WCxZ蛋白芯片篩選到A23187干預(yù)組與對照組的差異蛋白(P<0.05)表達量降低的蛋白質(zhì)荷比(m/z)表達量增高的蛋白質(zhì)荷比(m/z)les甲les寧lee甲..1甲
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【引證文獻】

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本文編號：2545966