【摘要】：目的：構(gòu)建結(jié)核新型DNA疫苗pcDNA3.1-Rv3615c-Mtb10.4-Rv2660c (p846)，評價(jià)其在抗結(jié)核感染中的保護(hù)作用，并探討發(fā)揮該保護(hù)作用的潛在機(jī)制。 方法：通過分子生物學(xué)的方法構(gòu)建含有結(jié)核桿菌三抗原融合表達(dá)質(zhì)粒p846及單個(gè)抗原表達(dá)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Rv3615c (pRv3615c)，pcDNA3.1-Mtb10.4(pMtb10.4)和pcDNA3.1-Rv2660c(pRv2660c)，測序鑒定正確后體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，western blot鑒定其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建三個(gè)單抗原及融合抗原846的原核表達(dá)質(zhì)粒，并應(yīng)用GST標(biāo)簽和His標(biāo)簽Ni柱親和層析技術(shù)進(jìn)行相關(guān)蛋白純化。將成功構(gòu)建的三抗原融合基因疫苗和單抗原疫苗以肌肉注射的方式對小鼠進(jìn)行免疫，具體免疫方式如下：選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分成6組，每組20只：p846組，pRv3615c組，pMtb10.4組，pRv2660c組，空載體pcDNA3.1組及BCG陽性對照組，每只小鼠每次使用50μg的重組質(zhì)粒于0、2、4、6周進(jìn)行免疫，其中BCG組在0周以5×106CFU的劑量皮下免疫一次。對免疫小鼠每隔兩周進(jìn)行一次血清中IgG抗體檢測。末次免疫后兩周，檢測相應(yīng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答類型：包括ELISPOT檢測產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量、Brdu試劑盒檢測T細(xì)胞增殖、LDH的釋放檢測T細(xì)胞的殺傷活性、流式細(xì)胞儀及ELISA檢測相關(guān)的細(xì)胞因子等。末次免疫后4周，進(jìn)行BCG攻毒，并于攻毒后的4-6周進(jìn)行該疫苗的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)檢測（組織病理切片和CFU實(shí)驗(yàn)等），免疫后未攻毒的各組小鼠再繼續(xù)飼養(yǎng)用于相關(guān)的記憶性T細(xì)胞的檢測。 結(jié)果：1.構(gòu)建了結(jié)核桿菌三抗原融合DNA疫苗p846，和單抗原DNA疫苗pRv3615c， pMtb10.4，pRv2660c及其原核表達(dá)質(zhì)粒；2.細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測結(jié)果如下：1）特異性T淋巴細(xì)胞增殖ELISA（Brdu）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的p846融合抗原疫苗可有效促進(jìn)T細(xì)胞的特異性增殖，尤其在滅活的H37Rv和TFP846蛋白的刺激下，其OD值達(dá)2.5左右，顯著高于單抗原疫苗組和空載體組（p0.05）；2）IFN-γ的ELISPOT檢測結(jié)果顯示，與單抗原疫苗免疫組相比，三抗原融合基因疫苗p846可大量促進(jìn)分泌IFN-γ的T細(xì)胞的產(chǎn)生；脾臟培養(yǎng)上清相關(guān)細(xì)胞因子的檢測，發(fā)現(xiàn)p846疫苗免疫組顯著增加了Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ和TNF-α的分泌，同時(shí)也促進(jìn)了和Th1型應(yīng)答密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2和IL-17A的產(chǎn)生，與ELISPOT結(jié)果相一致；3）通過胞內(nèi)染色分析了p846疫苗誘生的體內(nèi)特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)p846疫苗免疫組脾臟CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比例分別為6.45%和7.61%；CD4+IL-2+和CD8+IL-2+T細(xì)胞比例分別為24.1%，20.2%；CD4+TNF-α+和CD8+TNF-α+T細(xì)胞比例分別為59.3%，71.3%，相對單抗原疫苗組(尤其是CD4+T細(xì)胞)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）；3.體液免疫應(yīng)答檢測結(jié)果：通過小鼠血清中IgG抗體的檢測發(fā)現(xiàn)p846疫苗可以誘生大量的高親和力抗體的產(chǎn)生，OD值達(dá)3.25左右，滴度達(dá)1:4500，且主要以IgG2a亞型為主；4.組織病理切片HE染色的結(jié)果顯示，攻毒后6周，p846疫苗免疫的小鼠：大部分肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)充血、出血明顯減少，肺間質(zhì)內(nèi)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤；而單抗原疫苗組及空載體組的小鼠：大部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)有大量充血、出血且有大量炎性細(xì)胞浸潤；5.肺臟和脾臟CFU的結(jié)果顯示，p846疫苗免疫組小鼠肺部結(jié)核菌載量即Log10CFU約為3.50，脾臟的Log10CFU約為2.70，相對于單抗原疫苗組（其中肺臟Log10CFU約為5.5，脾臟的Log10CFU約為5.0），有顯著性差異(p0.05)；6.記憶性T細(xì)胞檢測顯示p846疫苗可顯著促進(jìn)效應(yīng)型記憶性CD4+T（CD25-CD44+CD62L-CCR7-）細(xì)胞的產(chǎn)生，其值可達(dá)53.6%，相對于單抗原疫苗組pRv3615c的46.1%，pMtb10.4的45.5%，pRv2660c的41.0%和空載組的37.3%，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。 結(jié)論：我們構(gòu)建的新型結(jié)核三抗原融合DNA疫苗p846免疫小鼠后，不僅能誘生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答和一定的體液免疫應(yīng)答，還能有效的發(fā)揮抗結(jié)核桿菌感染的作用，，也可有效促使效應(yīng)型記憶性CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生，且保護(hù)效果優(yōu)于單抗原DNA疫苗，有望成為一種能有效阻止結(jié)核桿菌復(fù)制和結(jié)核病復(fù)發(fā)的新型疫苗。
【圖文】：

pRv3615c，pMtb10.4，pRv2660c及p846的酶切鑒定圖

BpRv3615c的測序結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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本文編號：2521405