發(fā)布時間：2019-07-11 15:10

【摘要】： 目的胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)成為當今生命科學和生物技術研究的熱點,這是因為它具有自我更新和多能分化的能力。多年來,“成體組織中是否存在胚胎干細胞”一直是一個很有爭議的問題,很多實驗室已報道可以從骨髓中分離出來ESCs樣的多能干細胞,這些細胞都表達ESCs特異性標志Oct4基因,能像ESCs一樣無限分裂繁殖,而且可以分化成幾乎所有類型的細胞。但是對于這些原始細胞的來源和存在機制,人們并不清楚。因此,骨髓中是否存在ESCs就變成了一個很有爭議的問題。 之前的研究都是通過不同的方法從骨髓中分離、提取并培養(yǎng)這些ESCs樣的干細胞,而我們首次通過相反的方式直接將小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里,通過觀察ESCs在體內的分布生長情況,從而思考體內是否有這樣一個適宜ESCs生存的環(huán)境。 方法為了更好地追蹤ESCs在體內的生長情況,我們新建兩株帶綠色熒光標記(green fluorescent protein, GFP)的ESCs——oGFP+ESCs(C57BL／6xOct4／EGFP轉基因OG2小鼠)；和aGFP+ESCs(129／SvxCAG／EGFP轉基因C57BL／6-Tg小鼠)。oGFP+ESCs中GFP的表達受Oct4啟動子調控,Oct4表達時GFP才表達；aGFP+ESCs中GFP的表達受chicken-beta-actin啟動子調控,無論細胞分化與否,GFP均表達。為了避免了ESCs在體內其它器官的阻滯和損失,我們直接將ESCs通過脛骨注射植入到同源的C57BL／6小鼠(分照射組和非照射組)骨鏈腔內。 移植后,通過雙光子熒光顯微鏡來觀察GFP+細胞在小鼠骨髓腔里存活的時間和狀態(tài)。另在不同的時間點,我們從移植小鼠的骨髓腔里再次分離出這些GFP+的細胞,采用建立ES細胞系的方法使這些Oct4+-GFP+細胞建成穩(wěn)定細胞系,并檢測這些新建細胞系的功能。通過基因芯片檢測來比較這些細胞系和母代ESCs在基因表達水平上的差異。另一方面,我們通過流式細胞學檢測和體外培養(yǎng)的方式,分析移植的ESCs在骨髓這種造血微環(huán)境下的分化特征。 結果通過雙光子熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)100天后,骨髓中仍然存在Oct4-GFP表達的類似ESCs的細胞。大多數GFP+細胞位于移植側脛骨的注射部位,也有少部分GFP+細胞位于注射骨對側的骨髓腔內。在不同的時間點,我們從移植小鼠的骨髓腔里分離出這些Oct4+-GFP+的細胞,建成穩(wěn)定細胞系。到目前為止,我們成功建立了8株細胞系,形態(tài)同ESCs。通過對這些Oct4+細胞系的功能性檢測發(fā)現(xiàn)它們具有與ESCs相似的特性,但這種細胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低,且不能生殖系傳遞。芯片結果顯示這些細胞與母代ESCs比較,部分基因表達水平發(fā)生了改變,表觀遺傳學也發(fā)生了逐漸的變化。 另外,移植的ESCs在骨髓腔內大多數分化成了非造血的細胞,形態(tài)多樣,與骨質連接緊密,而僅有少部分分化成了造血細胞,并可進入血循環(huán)。結論1)我們的研究首次通過直接將ESCs移植入小鼠骨髓腔來證實了成體環(huán)境中長期存在ESCs的可能性,對以后干細胞的應用,在成體內的發(fā)育和分化研究具有一定的提示作用； 2)由于原始的胚胎干細胞在體內可以長期存在,因此在使用ESCs或ESCs衍生物做細胞治療或移植過程中,安全性一定要長期關注； 3)胚胎干細胞在成體骨髓中存活一段時間后,逐漸發(fā)生了表觀遺傳學方面的變化,這種變化影響了ESCs的多能性改變,因此在以后細胞移植過程中,我們需要關注這些細胞表觀遺傳學方面的影響； 4)ESCs在骨髓腔內存活一段時間后,大多數分化成了非造血細胞。我們的研究首次說明了ESCs在骨髓微環(huán)境的分化趨勢,對ESCs的分化潛能和周圍環(huán)境的關系以及ESCs的應用具有一定的提示作用。
文內圖片：
圖片說明： 1.feeder細胞的形態(tài)和密度:feeder細胞很容易貼壁，復蘇后6小時基本貼壁牢固，這些細胞不增殖，只提供ESCs生長的養(yǎng)份，分裂細胞因子抑制ESC分化，因此需要合適密度的feeder細胞，太稀或太密，ESCs均容易分化，圖1一1中feeder細胞的密度較適用于小鼠ESCs的培養(yǎng)。圖1一1:典型的滋養(yǎng)層細胞形態(tài)和密度2.成功建立不同品系的帶GFP熒光標記的小鼠胚胎干細胞系:通過不同品系的小鼠與相應的轉基因小鼠交配 :oGFP+Eses(e57BLz6XoeZ);aGrP+Eses(12叨SvXe57Bu6一Tg)。oorP+EsCs:GFp的表達受oct’啟動子調控，oct4表達時GFP才表達 ;aGFP+ESCs:GFP的表達受chinken一p一actin啟動子和巨細胞病毒增強子調控，，即無論細胞分化與否，Oct4均表達。取交配后 E3.5囊胚(GFP+)種于feeder上面，3一5天內細胞團形成典型綠色克隆(圖1一2)，將綠色克隆挑出接種到預先鋪有feeder的96孔板里，一個孔一個克隆，通過逐步消化傳代擴增，形成兩株穩(wěn)定的形態(tài)較好的小鼠胚胎干細胞系(圖1一3)。ESCs呈一個一個克隆生長，邊緣光滑，表面平滑，結構致密
文內圖片：
圖片說明： 北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院博士研究生學位論文(二)雙光子觀察GFP+細胞1.光譜學分析:GFP的發(fā)射光譜是一條類似正態(tài)分布的曲線(圖2一2)，最大峰值為 509nm，而如果是噪音或者自發(fā)熒光，它的光譜是沒有規(guī)律的或者一直很高呈一平線(圖2一3)。圖2一 2:GFP十細胞的發(fā)射光譜曲線圖2一3:自發(fā)熒光光譜曲線無規(guī)律2.雙光子觀察中，我們用glonln作為激發(fā)波長。兩個NDD頻道同時收集圖像，綠色NDD頻道的發(fā)射濾光器是495一54OIun，而紅色NDD頻道的發(fā)射濾光器是570一625run。在綠色NDD頻道可見，而在紅色NDD頻道不可見的信號，即為GFP信號。因此結合兩個NDD頻道的成像和光譜學分析
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 韋多;王彥;高選;沈蕓;徐凱;趙躍然;趙力新;陳子江;;小鼠孤雌胚胎干細胞直接向神經細胞誘導分化的實驗研究[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2008年05期

2 蔡耘;黃紹良;張緒超;黃永蘭;黃科;陳惠芹;李萍;;骨髓腔內途徑臍血與間質干細胞共移植對造血重建的實驗研究[J];中國病理生理雜志;2008年01期

本文編號：2513250