【摘要】： 目的: 培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓(bone marrow,BM)、人胎盤(placenta)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs);探討其定向誘導(dǎo)分化為膽堿能樣神經(jīng)元的有效條件。 材料方法: 1.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 1.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng):使用全骨髓法將獲取的骨髓直接種植到含10%FBs+DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置于37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔72h換液1次,7-10d首次傳代。 1.2.人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的酶消化法分離培養(yǎng):剪碎后先使用膠原酶Ⅱ消化后再用胰蛋白酶,反復(fù)吹打使成單細(xì)胞懸液和外植塊混合物,100目濾網(wǎng)過濾收集單細(xì)胞,離心獲得單個(gè)核細(xì)胞,懸浮于低糖DMEM培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2和100%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),隨后每3～4d換液1次,經(jīng)3～4周可見成纖維樣細(xì)胞在瓶底匯合成片狀。 2.間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化誘導(dǎo) 2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化誘導(dǎo):取2～4代MSCs,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組:10%FBS(胎牛血清)誘導(dǎo)2d;換液為DMEM/F12加入bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、2-ME(巰基乙醇)、RA(維甲酸)、NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)繼續(xù)誘導(dǎo)8d。實(shí)驗(yàn)Ⅱ組:在Ⅰ組方案的基礎(chǔ)上加入EGF(表皮生長(zhǎng)因子)、Heparin繼續(xù)誘導(dǎo)8d。空白對(duì)照組使用DMEM/F12培養(yǎng)液不加任何誘導(dǎo)劑連續(xù)培養(yǎng)10d,。 2.2人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化誘導(dǎo):取4代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組:10μg/LbFGF+10%FBS(胎牛血清)誘導(dǎo)2d;換液為DMEM/F12加入bFGF、2-ME、RA、NGF繼續(xù)誘導(dǎo)19d。實(shí)驗(yàn)Ⅱ組:在Ⅰ組方案的基礎(chǔ)上加入EGF(表皮生長(zhǎng)因子)、Heparin繼續(xù)誘導(dǎo)19d�？瞻讓�(duì)照組使用含DMEM/F12培養(yǎng)液不加任何誘導(dǎo)劑連續(xù)培養(yǎng)21d,。 3.倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)不同天數(shù)后的形態(tài)變化,SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 4.取誘導(dǎo)的MSCs,采用RT-PCR檢測(cè)及凝膠電泳分析nestin,nurrl,chatmRNA的表達(dá),均以β-actin作為內(nèi)參照。 5.間接免疫熒光法檢測(cè)Nestin,ChAT,NeuN,AchE陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞表面部分標(biāo)志抗原成分及誘導(dǎo)分化后不同時(shí)間段的Nestin,ChAT,NeuN,AchE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及向膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化率 7.ELISA方法檢測(cè)不同時(shí)間段的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的上清液的終產(chǎn)物乙酰膽堿的表達(dá)含量 結(jié)果: 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化誘導(dǎo)結(jié)果:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化:誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或橢圓形,突起形成,胞間或細(xì)胞與間質(zhì)形成連接或神經(jīng)球,胞漿內(nèi)分泌顆粒增加�？瞻讓�(duì)照組第1、3、5、10天細(xì)胞形態(tài)變化率波動(dòng)于1%左右,實(shí)驗(yàn)組變化率明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)意義。誘導(dǎo)后的細(xì)胞高表達(dá)nestin、nurrl、chat mRNA,實(shí)驗(yàn)組間基因表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度比較有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.01)。免疫熒光法檢測(cè)顯示,實(shí)驗(yàn)組Nestin,ChAT,NeuN,AchE陽(yáng)性分化細(xì)胞率約50-80%,而空白對(duì)照組ChAT陽(yáng)性分化細(xì)胞表達(dá)率僅約為1%。 2.人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞分化誘導(dǎo)結(jié)果:誘導(dǎo)后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)變化與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),人胎盤MSCs強(qiáng)表達(dá)透明質(zhì)酸受體CD44和整合素家族成員CD29,陽(yáng)性率分別為99.8%,99.7%;不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34(4.8%)和CD45(0.9%),也不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD106(2.3%)。hPMSCs(人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞)不表達(dá)HLA-DR(1.0%);14d誘導(dǎo)后的兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均表達(dá)nestin、chatmRNA,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組(FMRN組)Nestin、AchE、ChAT,表達(dá)陽(yáng)性率分別為29.7%,85.8%,24.5%;實(shí)驗(yàn)Ⅱ組(FMRENH組)分別為76.3%,98.2%,10.4%,陰性對(duì)照組分別為1.9%,10.8%,4.5%。ELISA方法檢測(cè)示,對(duì)照組第4代胎盤MSCs、實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組誘導(dǎo)1、2、3周的上清乙酰膽堿濃度分別為0±4.6nmol/1、0±4.7 nmol/1、20±9.4 nmol/1:638.9±7.9 nmol/1、393.6±10.3nmol/1、905.1±10.1 nmol/1:39.2±26.6 nmol/1、82.1±23.2 nmol/1、234.9±19.2 nmol/l。組間比較差異明顯P＜0.01 結(jié)論: 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞能在體外培養(yǎng)擴(kuò)增,并可以在誘導(dǎo)劑作用下,在體外誘導(dǎo)分化為具有合成及釋放降解乙酰膽堿能力的膽堿能樣神經(jīng)元細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組有較高的分化率。 2.人胎盤MSCs強(qiáng)表達(dá)CD44、CD29;不表達(dá)CD34、CD45(0.9%)、CD106、HLA-DR
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 撒亞蓮,李海標(biāo);川芎嗪誘導(dǎo)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究[J];解剖學(xué)報(bào);2003年05期

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本文編號(hào)：2513048