【摘要】： 目的： ZCH-2B8a單克隆抗體由本研究室采用經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)制備而成，，經(jīng)HLDA8協(xié)作組鑒定后認為屬國際上尚未認識的造血細胞膜新的分化抗原或新的CD分子，前期研究表明該抗原(Ag)可能為一活化分子。因此有必要對該Ag進一步研究以明確該其蛋白序列及其表達譜、是否為一新的活化分子及它的功能，開發(fā)其潛在的應(yīng)用價值。 方法： 本研究主要包括以下四部分：(1)制備2B8a FITC直標抗體：采用SPASepharose親和層析法從腹水中純化2B8a抗體；聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)鑒定抗體純度及分子量；采用改良Marshall法制備2B8a FITC直標抗體，并通過流式細胞術(shù)鑒定。(2)檢測2B8a Ag的分布情況：采用流式細胞術(shù)檢測2B8a Ag在外周組織、正常外周血、白血病細胞、細胞株上的分布；采用激光共聚焦顯微鏡觀察2B8a Ag在細胞上的定位。(3)2B8a Ag的功能研究：通過流式細胞術(shù)檢測PHA刺激后T細胞活化過程中2B8a的表達規(guī)律；檢測再生障礙性貧血等病人外周血標本2B8a Ag的表達情況及與其他活化標志的相關(guān)性；利用流式細胞微球技術(shù)(CBA)檢測2B8a Ab對活化T細胞分泌細胞因子的影響；通過2B8a抗體封閉Raji細胞的Ag表位檢測它與骨髓基質(zhì)細胞粘附能力的變化；通過木瓜酶酶切法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測2B8a Ag介導抗體內(nèi)化的能力；通過補體依賴的細胞毒實驗(CDC)了解2B8a Ab與Ag特異性結(jié)合及激活補體的能力。(4)2B8a Ag蛋白的鑒定：將Raji細胞蛋白裂解液經(jīng)免疫共沉淀法純化后行SDS-PAGE檢測，膠上的Ag蛋白條帶送肽質(zhì)量指紋圖及串聯(lián)質(zhì)譜分析；Western blot法鑒定2B8a Ag蛋白的分子量。 結(jié)果： 經(jīng)SDS-PAGE鑒定，2B8a抗體的重鏈和輕鏈分子量分別為52 kDa和9 kDa。2B8a直標法(2B8a FITC)和間標法(2B8a+GAM-FITC)與Raji細胞陽性反應(yīng)率分別為98．48%和98．35%，與Molt-3細胞陽性反應(yīng)率分別為9．35%和10．80%。2B8a Ag在正常外周血的T細胞表面不表達(5．4±3．8%)，B細胞表面弱表達(29．9±14．8%)，而中性粒細胞(92．2±8．7%)和單核細胞(81．9±19．3%)表面表達較強。在B系急性淋巴細胞白血病細胞表面，該Ag的表達較對照組顯著增強(中位值99．0%vs．43．9%)。該Ag在所檢測B系、T系、髓系的外周血細胞和腫瘤細胞株的胞漿內(nèi)呈高表達。2B8a Ag在活化T細胞上的表達規(guī)律與CD69、CD25和HLA-DR不同，在T細胞受PHA刺激后12h內(nèi)即可表達于胞膜上，72～96h達高峰。再生障礙性貧血(AA)等免疫相關(guān)疾病的T細胞表面，該Ag的表達明顯上調(diào)(AA：CD4~+T細胞陽性率90．9%，CD8~+T細胞陽性率72．7%)。采用2B8a抗體封閉抗原表位后并不能減少Raji細胞與骨髓基質(zhì)細胞的粘附(2h、4h、6h和12h時2B8a組與對照組的粘附率比分別為0．87、1．02、1．02和0．96，均為P＞0．05)，也并不影響T細胞活化后細胞因子的分泌水平和活化狀態(tài)(PHA組與PHA+2B8a組IL-2中位值：425pg/ml vs．442pg/ml，P=0．465)。與3A4抗體在37℃時才能逐漸內(nèi)化不同，2B8a抗體在4℃和37℃均可以快速“內(nèi)化”(2B8a FITC與Raji細胞4℃和37℃孵育5min后再行木瓜酶酶切，流式檢測陽性反應(yīng)率分別達到76．7±2．5%和89．2±1．5%)。2B8a抗體能激活補體，介導CDC作用殺傷Raji細胞(按0．1μg抗體：10μl補體：5×10~4細胞的比例，Raji細胞死亡率88．6±7．9%)，而對Molt-3細胞基本無殺傷作用(死亡率3．6±0．6%)。將Raji細胞裂解液經(jīng)免疫共沉淀純化2B8a Ag后，Western blot鑒定證實該Ag的分子量為50 kDa左右。質(zhì)譜分析未能明確得到唯一、可靠的蛋白序列，通過蛋白數(shù)據(jù)庫比對及功能研究，冠蛋白的可能性較大，但它在表達譜上與2B8a Ag仍有較大不同。 結(jié)論： (1)本研究自行研制的2B8a FITC熒光抗體具有良好的敏感性和特異性； (2)2B8a Ag在淋巴結(jié)、扁桃體、肝臟及胰腺組織中可檢測到；在外周血，它主要分布在活化T細胞、B細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞膜和細胞漿，而在靜息T細胞膜上不表達，但在其胞漿中表達也很強； (3)2B8a Ag是一個早期穩(wěn)定的T細胞活化標志；在再生障礙性貧血等免疫相關(guān)疾病中表達上調(diào)； (4)2B8a Ag可以介導抗體迅速內(nèi)化； (5)2B8a Ab能激活補體，發(fā)揮明顯的CDC作用； (6)2B8a Ag不能介導細胞間的粘附；對活化T細胞的細胞因子分泌無明顯影響； (7)質(zhì)譜分析未能在現(xiàn)有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索到與2B8a Ag相匹配的蛋白，該抗原可能為一新的蛋白分子。
[Abstract]:Purpose: The ZCH-2B8a monoclonal antibody is prepared by using the classical hybridoma technique in the laboratory, and it is considered to be a new differentiation antigen or a new CD molecule of the hematopoietic cell membrane which has not been recognized in the world after being identified by the HLDA8 cooperative group. The previous study indicates that the antigen (Ag) may be a living cell. It is therefore necessary to further study the Ag to define the protein sequence and its expression profile, whether it is a new activating molecule and its function, and to develop its potential value Methods: This study mainly includes the following four parts: (1) Preparation of 2B8a FITC direct-labeled antibody: purifying the 2B8a antibody from ascitic fluid by using the SPASephron affinity chromatography, and identifying the purity and molecular weight of the antibody by means of SDS-PAGE; and using the modified Marshall method to prepare 2. B8a FITC direct-labeled antibody And the distribution of 2B8a Ag was detected by flow cytometry. The distribution of 2B8a Ag in peripheral tissues, normal peripheral blood, leukemia cells and cell lines was detected by flow cytometry. (3) The function of 2B8a Ag: The expression of 2B8a in peripheral blood of patients with aplastic anemia was detected by flow cytometry, and the expression of 2B8a Ag in peripheral blood of patients with aplastic anemia was detected. Correlations with other activation markers; the effect of 2B8a Ab on the secretion of cytokines in activated T cells by flow cytometry (CBA); the detection of the Ag epitope of Raji cells by the 2B8a antibody and the bone marrow Changes of the adhesion ability of the matrix cells; the ability of the 2B8a Ag-mediated antibody to be internalized by the enzyme-cutting of the papain and the flow cytometry;2 B8a Ab and Ag-specific by the complement-dependent cytotoxicity assay (CDC) The ability of binding and activating complement. (4) Identification of the 2B8a Ag protein: the Raji cell protein lysate was purified by the immunoprecipitation method, and the SDS-PAGE was detected by SDS-PAGE, and the Ag protein band on the gel was sent to the peptide mass fingerprint and the tandem mass spectrum analysis; and the Western blot method was used to identify 2. B8a The molecular weight of the Ag protein was determined by SDS-PAGE. The heavy chain and light chain molecular weight of the 2B8a antibody were 52 kDa and 9 kDa, respectively. The 2B8a direct standard method (2B8a FITC) and the m-standard method (2B8a + GAM-FITC) were positive for Raji cells. The reaction rates were 98.48% and 98.35%, respectively. The positive rate of reaction with Molt-3 cells was 9.35% and 10.80%, respectively. The expression of Ag in B-series acute lymphoblastic leukemia cells increased significantly compared with the control group. The expression of 2B8a Ag on activated T cells was different from that of CD69, CD25 and HLA-DR. The positive rate of Ag expression was up-regulated (AA: CD4 + T cell positive rate was 90.9). The rate of adhesion between Raji cells and bone marrow stromal cells (2 h,4 h,6 h, and 12 h) was 0.87, 1.02 respectively after the antigen epitope was closed by the 2B8a antibody and the adhesion of Raji cells to the bone marrow stromal cells (2 h,4 h,6 h and 12 h) was not reduced. 1.02 and 0.96 (both P> 0.05) and did not affect the level of secretion and activation of cytokines after T cell activation (PHA group and PHA + 2 B8a group IL-2 median value:425 pg/ ml v (s.442 pg/ ml, P = 0.465). 2 (1.5%). The B8a antibody can activate complement and mediate CDC to kill Raji cells (according to 0.1. mu.g of antibody:10. mu. l complement:5%10-4 cells, Raji cell death rate of 88.6% 7.9%), and Molt-3 cell group The cell lysate of Raji was purified by immunoprecipitation and purified by Western blot. the molecular weight of the Ag is confirmed to be about 50 kDa. The mass spectrum analysis fails to clearly obtain a unique and reliable protein sequence, It's in the table The results are as follows: (1) The study itself The 2B8a FITC fluorescent antibody has good sensitivity and specificity; (2) 2B8a Ag is in the lymph node, tonsil, liver and pancreas can be detected in peripheral blood, which is mainly distributed in activated T cells, B cells, monocytes, neutrophils, The cell membrane and the cell pulp were not expressed on the resting T cell membrane, but the expression was also strong in its cytoplasm; (3) 2B8a Ag was An early-stable T-cell activation marker; in regeneration Up-regulation of expression in immune-related diseases, such as anemia; (4) 2B8 a) Ag can mediate the rapid internalization of the antibody; (5) 2B8a Ab can activate complement and play a significant role in C (6) 2B8a Ag could not mediate the adhesion between cells;
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2509012