【摘要】： 由于冷凍干燥法具有其它長(zhǎng)期保存法無(wú)法比擬的一些優(yōu)點(diǎn),該方法已成為細(xì)胞長(zhǎng)期保存方法中新的研究熱點(diǎn)。所以凍干保存也有可能成為最有效的紅細(xì)胞長(zhǎng)期保存方法。但影響凍干細(xì)胞回收率的因素非常多,包括凍干前紅細(xì)胞的處理、保護(hù)劑組成(成份和濃度)、添加洗滌方式、冷凍過(guò)程、干燥過(guò)程和復(fù)水等。維持紅細(xì)胞胞膜完整性和紅細(xì)胞的生理功能是紅細(xì)胞凍干成功的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。本論文將圍繞紅細(xì)胞在凍干前負(fù)載海藻糖及其對(duì)紅細(xì)胞理化特性的影響、凍干保護(hù)液的選擇、凍干過(guò)程中對(duì)紅細(xì)胞的影響因素以及復(fù)水條件對(duì)紅細(xì)胞回收率的影響這一條主線展開討論,通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究這些因素對(duì)人的紅細(xì)胞凍干效果的影響,并對(duì)人紅細(xì)胞凍干和復(fù)水方法進(jìn)行優(yōu)化。 一、凍干前人紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的負(fù)載及其對(duì)紅細(xì)胞理化特性的影響 第一部分研究了紅細(xì)胞負(fù)載海藻糖的影響因素和有效方法,并通過(guò)評(píng)價(jià)負(fù)載海藻糖對(duì)紅細(xì)胞各項(xiàng)理化指標(biāo)的影響,證明負(fù)載后紅細(xì)胞仍然能較好的執(zhí)行其生理功能。使用硫酸-蒽酮法測(cè)定胞內(nèi)海藻糖含量,同時(shí)對(duì)胞外游離血紅蛋白水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢測(cè)負(fù)載后紅細(xì)胞各項(xiàng)理化指標(biāo),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)負(fù)載后紅細(xì)胞膜的完整性。結(jié)果顯示紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的負(fù)載量和負(fù)載溫度、時(shí)間及負(fù)載緩沖液海藻糖濃度密切相關(guān),隨溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)和負(fù)載緩沖液海藻糖濃度的增加,紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的攝取量也隨之增加。兩組紅細(xì)胞各項(xiàng)理化指標(biāo)比較結(jié)果為兩組各項(xiàng)指標(biāo)間無(wú)顯著差異((p＞0.05))。流式結(jié)果顯示紅細(xì)胞在高滲環(huán)境中負(fù)載海藻糖后,細(xì)胞膜結(jié)合很少量Annexin-V-FITC,并且破損紅細(xì)胞能被有效清除。 確定紅細(xì)胞負(fù)載海藻糖的最佳條件,即,在37℃條件下,采用新鮮紅細(xì)胞在海藻糖濃度為800mmol/L的負(fù)載緩沖液中孵育7h能有效攝取海藻糖,且保持細(xì)胞的理化穩(wěn)定性和膜結(jié)構(gòu)完整性,為紅細(xì)胞的長(zhǎng)期凍干保存奠定了基礎(chǔ)。 二、人紅細(xì)胞凍干保存中保護(hù)劑和凍干程序的優(yōu)化 第二部分中通過(guò)一系列對(duì)比實(shí)驗(yàn),比較了不同保護(hù)劑濃度組成和凍干程序中凍干前紅細(xì)胞降溫速率、擱板最低溫度、升華干燥和解析干燥不同的升溫速率等幾種參數(shù)的設(shè)置對(duì)紅細(xì)胞凍干復(fù)水后存活率的影響。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將選擇如下保護(hù)劑來(lái)凍干紅細(xì)胞:0.8mol/LGlycerol+15%PVP40+150mmol/L海藻糖+2%RSA,其pH為7.3,。凍干中采用液氮快速降溫,即將液氮噴濺于凍干瓶上,使之達(dá)到平衡,然后迅速取出放置到已經(jīng)預(yù)冷至-70℃的擱板上開始凍干。凍干程序?yàn)?升華干燥中,設(shè)定擱板溫度保持為-70℃1h、-60℃2h、-50℃2h、-40℃2h、-30℃2h、-25℃2h、-20℃2h、-15℃2h、解析干燥中,設(shè)定擱板溫度保持為-10℃1h、0℃1h、10℃2h,干燥腔體內(nèi)壓力設(shè)定為150mTorr～200mTorr(約20Pa～27 Pa)。冷凝器溫度為-85℃。整個(gè)干燥過(guò)程持續(xù)時(shí)間大約19個(gè)小時(shí)。 三、凍干人紅細(xì)胞復(fù)水條件的初步研究 本部分通過(guò)研究不同復(fù)水條件對(duì)凍干紅細(xì)胞回收率的影響,包括復(fù)水溶液、復(fù)水溫度、復(fù)水階段紅細(xì)胞胞體積變化速率(即蒸汽預(yù)復(fù)水)等,對(duì)凍干紅細(xì)胞復(fù)水條件的優(yōu)化進(jìn)行初步研究,并檢測(cè)了凍干紅細(xì)胞復(fù)水后其各項(xiàng)理化功能的改變。 (1)不同復(fù)水條件對(duì)凍干紅細(xì)胞回收率的影響結(jié)果為:采用以PBS為基液配制的10%(w/v)PVP40溶液效果較好。比較不同復(fù)水溫度的影響,低于37℃時(shí),紅細(xì)胞回收率隨著溫度的升高而增加,42℃比37℃略差,即37℃下復(fù)水效果最好。在加入復(fù)水液之前將樣品放置在37℃的飽和蒸汽環(huán)境中預(yù)復(fù)水能提高紅細(xì)胞回收率。并使細(xì)胞體積和體積分布寬度更接近于新鮮細(xì)胞數(shù)值。 (2)通過(guò)對(duì)復(fù)水后紅細(xì)胞理化性質(zhì)的研究,發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞的變形性較常規(guī)保存紅細(xì)胞有所下降,但胞內(nèi)ATP酶、G-6-PD酶、SOD和2,3-DPG的活性降低較少,大于紅細(xì)胞回收率,說(shuō)明紅細(xì)胞在我們制備的凍干保護(hù)劑與設(shè)定的凍干過(guò)程下凍存后,細(xì)胞生化活性保存較好。同時(shí)也提示也提示對(duì)凍干復(fù)水過(guò)程中的細(xì)胞膜的保護(hù)還需進(jìn)行更深入的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 周俊,劉景漢,歐陽(yáng)錫林,莊遠(yuǎn),李錫金;血小板胞內(nèi)海藻糖測(cè)定方法的建立和評(píng)價(jià)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2004年06期

2 陳燕;陸志剛;;海藻糖用于血細(xì)胞凍干保存中的研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2006年02期

3 權(quán)國(guó)波;呂翠翠;劉敏霞;扈文博;王艷;韓穎;;人紅細(xì)胞對(duì)糖類攝取的規(guī)律性研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2006年03期

4 陳燕;陸志剛;韓穎;;海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞及其凍干保存研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2006年03期

，

本文編號(hào)：2406597