【摘要】： 幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是人類(lèi)最常見(jiàn)的致病菌,其感染與人慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、MALT淋巴瘤和胃腺癌等有重要關(guān)系。H.pylori是唯一能在胃內(nèi)酸性環(huán)境定植的細(xì)菌。在酸性環(huán)境下,尿素通道蛋白(UreI)激活尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨,而氨的生成是H.pylori對(duì)抗胃酸、耐受胃酸以及在胃內(nèi)定植的基礎(chǔ),因此UreI是H.pylori在胃內(nèi)定植最關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。H.pylori持續(xù)感染狀態(tài)與H.pylori UreI有重要的關(guān)系,抑制UreI的表達(dá),從而抑制尿素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),使H.pylori對(duì)酸不耐受,進(jìn)而不能在胃內(nèi)強(qiáng)酸環(huán)境中定居,達(dá)到根除H.pylori及其相關(guān)性疾病的目的,因此以UreI為抗原的H.pylori疫苗將具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建H.pylori UreI基因原核及真核表達(dá)載體,再轉(zhuǎn)化/染表達(dá)菌/細(xì)胞,使其表達(dá)具有活性的大量的能夠分泌到細(xì)菌/細(xì)胞外的UreI蛋白,觀察其免疫性,研究H.pylori UreI的作用機(jī)理,探討其作為基因疫苗的可行性。 第一部分:H.pylori UreI編碼基因的原核重組載體的構(gòu)建、表達(dá)及其抗原性研究 1. pET32a(+)/UreI原核重組載體的構(gòu)建及其在E.coli BL21中表達(dá) 目的:構(gòu)建H.pylori UreI編碼基因的重組載體,并在E.coli BL21中表達(dá)。 方法:利用分子克隆技術(shù)以H.pylori DNA染色體為模板,擴(kuò)增H.pylori UreI編碼基因片段,將目的基因UreI與載體pET32a(+)分別經(jīng)kpn I和Hind Ill雙酶切,純化,連接。篩選陽(yáng)性重組載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21,以IPTG誘導(dǎo)BL21/pET32a(+)/UreI融合蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂純化后,用SDS-PAGE及Western blot進(jìn)行分析。 結(jié)果:經(jīng)酶切、測(cè)序分析表明,插入的基因片段為H.pylori UreI編碼基因,由585bp組成,與GenBank相應(yīng)菌株HP AM417609序列完全一致,無(wú)堿基突變。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示重組質(zhì)粒pET32a(+)/UreI在原核細(xì)胞中得到了高效融合表達(dá),其重組融合蛋白經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂純化后,其純度達(dá)95%以上;Western blot分析顯示,該重組融合蛋白能夠被6His鼠抗單克隆抗體所識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。 2. pQE30/UreI原核重組載體的構(gòu)建及其在BL21中表達(dá) 目的:將H.pylori UreI編碼基因,與質(zhì)粒pQE30連接,并在BL21中表達(dá)。 方法:從原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/UreI中,酶切并膠回收目的基因UreI,將其與同樣進(jìn)行酶切、純化的載體pQE30進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化并篩選含有目的基因的重組載體pQE30/UreI,并在BL21中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂純化后,12%SDS-PAGE及Western blot法檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物。 結(jié)果:經(jīng)單、雙酶切證實(shí)重組載體插入的基因片段為H.pylori UreI編碼基因,重組質(zhì)粒pQE30/UreI表達(dá)的目的蛋白約為21KD,可溶性表達(dá)產(chǎn)物占全菌總蛋白的20%以上,經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂純化后,其純度達(dá)90%。目的蛋白可被6His鼠抗單克隆抗體所識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。 第二部分:H.pylori UreI編碼基因的真核重組載體的構(gòu)建及表達(dá) 目的:構(gòu)建H.pylori UreI編碼基因的真核表達(dá)載體,并在COS-7中表達(dá)。 方法:以重組質(zhì)粒pET32a(+)/UreI為模板,PCR擴(kuò)增UreI基因片段,將目的基因UreI和真核表達(dá)載體pEGFP-N1分別經(jīng)Hind III和kpn I雙酶切,純化后進(jìn)行連接。篩選陽(yáng)性重組載體pEGFP-N1/UreI,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,免疫熒光法檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物及Western blot分析其抗原性。 結(jié)果:成功構(gòu)建了重組載體pEGFP-N1/UreI,經(jīng)免疫熒光分析顯示重組質(zhì)粒pEGFP-N1/UreI在真核細(xì)胞中得到了表達(dá),Western blot分析顯示,該重組蛋白具有良好的抗原性。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393515