【摘要】： 隨著人們生活水平的不斷提高,Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化發(fā)病率不斷提高,研究表明血漿中脂聯(lián)素(ADPN)的含量與這類疾病的發(fā)生成負相關(guān),因此檢測人血漿中脂聯(lián)素的含量可預知這類疾病的發(fā)生的可能性,可以盡早的為病人提供信息。目前檢測人血清中的脂聯(lián)素含量主要通過ELISA方法進行檢測,市面上的檢測試劑盒均為進口,國內(nèi)還沒有相關(guān)報道。 根據(jù)NCBI上公布的序列NM_004797.2,利用primer5.0設計一對引物。提取人脂肪組織總RNA,通過RT-PCR獲得732bp的人脂聯(lián)素全基因目的基因片段。將目的片段克隆入載體pET-CKS并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli TOP10F',進行PCR鑒定,堿裂解法提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定,鑒定為陽性的菌株進行測序,將測序結(jié)果與NCBI上的序列進行比對,閱讀框正確的重組質(zhì)粒命名為pET-CKS/ADPN。 重組質(zhì)粒pET-CKS/ADPN轉(zhuǎn)入表達菌E.coli BL21-gold中,在化學劑-異丙基硫代-β-D-半乳酸糖苷(IPTG)的作用自下進行誘導表達,SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體的形式出現(xiàn),Western blot檢測融合蛋白與兔抗人脂聯(lián)素抗體反應,證明其具有免疫反應性。通過誘導表達條件的優(yōu)化,確立了最佳的誘導條件為：30℃,0.1mM IPTG濃度,誘導表達8h。因融合蛋白氨基端含有6個組氨酸(His-tag),可以用鎳金屬親和層析純化目的蛋白,將純化得到的融合蛋白溶液進行透析復性,檢測其濃度較高,可進行動物免疫。 將復性的重組蛋白免疫家兔,間接ELISA檢測兔抗血清效價,在第六次免疫后,效價達到5×104左右,雙向瓊脂擴散實驗驗證兔抗血清效價,當其效價達到1：64后,殺兔取血,硫酸銨沉淀法和陰離子交換層析法純化兔抗人脂聯(lián)素多克隆抗體,測定其濃度為2.3mg/mL。 將抗人脂聯(lián)素單克隆抗體作為固相抗體,采用改良的碘酸鈉法,對人脂聯(lián)素多克隆抗體進行辣根過氧化物酶標記,作為標記抗體,初步建立人脂聯(lián)素雙抗體夾心ELISA檢測模式。棋盤滴定法確立人脂聯(lián)素單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1：1000,酶標抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1：1500。以重組脂聯(lián)素蛋白為標準品繪制出的標準曲線,線性范圍為2ng-10ng。臨床測定111份Ⅱ型糖尿病人血清脂聯(lián)素濃度為6.5±0.33ng/mL,89份非Ⅱ型糖尿病人血清脂聯(lián)素濃度為9.9±1.08ng/mLo 本文通過基因工程方法得到了有免疫活性的重組人脂聯(lián)素蛋白,制備了兔抗人脂聯(lián)素多克隆抗體,初步建立的人脂聯(lián)素雙抗體夾心檢測模型,為進一步研究脂聯(lián)素的生化性質(zhì)及生理功能和人脂聯(lián)素ELISA檢測試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:With the improvement of people's living standard, the incidence of type 鈪，

本文編號：2388500