【摘要】：研究背景：結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）是結(jié)核病的病原體；M.tb可隱藏于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)，通過干擾巨噬細(xì)胞吞噬和溶酶體成熟等機(jī)制，逃逸免疫系統(tǒng)的識(shí)別和殺傷。近年來，自噬（autophagy）在抗結(jié)核免疫中的作用受到廣泛的關(guān)注。許多的研究資料顯示：自噬信號(hào)的缺乏和抑制是M.tb逃逸巨噬細(xì)胞免疫識(shí)別和殺傷的關(guān)鍵因素之一。有研究表明，LPS參與誘導(dǎo)的自噬能克服吞噬體溶酶體成熟障礙，并促進(jìn)M.tb與自噬體共區(qū)域化，進(jìn)而通過自噬溶酶體途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)M.tb的清除。有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ及Th1/Th2細(xì)胞因子向Th1的極化等均可促進(jìn)人巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的自噬。進(jìn)一步闡明LPS對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核自噬和細(xì)胞因子的影響，對(duì)于研究LPS作為可能的抗結(jié)核藥物或免疫佐劑具有重要的臨床實(shí)際價(jià)值。 目的：研究LPS對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核自噬和細(xì)胞因子的影響。 方法：1.結(jié)核分枝桿菌減毒株M.tb（H37Ra）用蘇通氏液體培養(yǎng)基于細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個(gè)月后接種至羅琴氏固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)1個(gè)月，無菌接種環(huán)收集M.tb菌體于1ml勻漿器中，加入生理鹽水反復(fù)研磨，取細(xì)菌懸液，用生理鹽水經(jīng)10000rpm×2min洗滌3次，抗酸染色陽性且鏡下觀察細(xì)菌分散。分光光度計(jì)檢測(cè)菌液濃度，用生理鹽水配成濃度為5×106/ml的M.tb懸液，4°C備用。 2.透射電鏡觀察LPS（100ng/ml）對(duì)感染M.tb的THP-1巨噬細(xì)胞自噬的影響。 3.熒光定量PCR檢測(cè)LPS（100ng/ml）對(duì)感染M.tb前后THP-1(A)細(xì)胞內(nèi)IL-12p35和IL-12p40基因表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)LPS對(duì)THP-1(A)細(xì)胞IL-12P70蛋白分泌的影響，Western blot檢測(cè)THP-1(A)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II蛋白表達(dá)水平。 4.以特異性阻斷劑三甲基嘌呤3-MA（3-Methyladenine)阻斷自噬，熒光定量PCR和ELISA檢測(cè)LPS（100ng/ml）對(duì)THP-1來源巨噬細(xì)胞IL-12表達(dá)的影響。 5.健康人和結(jié)核病患者各5例，取外周抗凝血，加入佛波醇酯（PMA）和鈣離霉素（Ionomycin）刺激2小時(shí)后，加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記抗體anti-CD3-APC，anti-CD8-PECY5.5染色，透膜后再加細(xì)胞因子熒光標(biāo)記單抗anti-IFN-γ和anti-IL-4進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IFN-γ和IL-4的T細(xì)胞亞群的比例。 6.健康人和結(jié)核病患者各5例，取外周抗凝血各4ml，分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用含5%NBS RPMI-1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，濃度為1.5×106ml，接種于24孔培養(yǎng)板，于結(jié)核病人孔加入100ng/ml LPS，培養(yǎng)24h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IFN-γ和IL-4的T細(xì)胞亞群的比例。 結(jié)果：1.透射電鏡觀察100ng/ml的LPS能夠促進(jìn)M.tb感染的THP-1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自噬。 2Western blot結(jié)果顯示LPS可顯著上調(diào)M.tb感染的THP-1巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)水平。 3.熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS可顯著上調(diào)M.tb感染的THP-1巨噬細(xì)胞IL-12p35和IL-12p40基因表達(dá)水平，自噬特異性阻斷劑3-MA（5Mm）預(yù)處理可顯著抑制這一效應(yīng)(p0.05)。 4. ELISA結(jié)果顯示，M.tb感染THP-1來源巨噬細(xì)胞上清液中IL-12p70蛋白含量（28.63±5.78）與未感染組（25.03±4.32）相比，差異無顯著性（p0.05）；M.tb感染THP-1來源巨噬細(xì)胞，經(jīng)LPS刺激, IL-12p70蛋白含量(291.23±25.75)較未刺激組（28.63±5.78)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05），自噬特異性阻斷劑3-MA（5Mm）可顯著抑制上述效應(yīng)（p0.05）。 5.健康人外周血T細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)水平(11.45±4.10)%， IL-4表達(dá)水平(0.92±0.98)%，，與結(jié)核病患者組(5.11±1.17)%及(1.66±0.34)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。 6.100ng/ml LPS刺激組結(jié)核病患者外周血T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平(8.43±1.39)%明顯高于未處理組(6.12±1.65)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）；刺激組IL-4表達(dá)水平(1.43±0.44)%與未處理組(2.03±0.66)%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論：1. LPS能夠上調(diào)結(jié)核病患者外周血受抑制的Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)； 2. LPS對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核自噬和細(xì)胞因子表達(dá)水平有顯著促進(jìn)作用； 3. LPS可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬水平，上調(diào)抗結(jié)核細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄧國防;雷建平;;結(jié)核病與相關(guān)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子[J];中國防癆雜志;2008年05期

2 王琳,蔡映云,程秋蘭,胡瑛,肖和平;肺結(jié)核患者的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2002年09期

本文編號(hào)：2388229