【摘要】： 目的 1.克隆土撥鼠和旱獺CD4分子。制備多克隆,單克隆抗體,并對其特性進(jìn)行初步鑒定。 2.建立小鼠和旱獺的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測方法,為wCD4抗體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 方法 1.從土撥鼠PBMC中克隆CD4的cDNA序列,測序并比對分析wCD4和其它哺乳動(dòng)物CD4的核苷酸、氨基酸同源性。 2.從中國旱獺PBMC中克隆CD4的cDNA序列,測序并比對分析wCD4和cwCD4序列同源性。 3.從旱獺肝組織或新鮮分離的PBMC中,用蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提的方法獲得DNA。PCR擴(kuò)增旱獺細(xì)胞色素b基因進(jìn)行種系發(fā)生分析。 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測感染W(wǎng)HV的旱獺肝內(nèi)CD4的表達(dá)水平的變化。為以后的CD4抗體體內(nèi)試驗(yàn)提供理論依據(jù)。 5.原核誘導(dǎo)表達(dá)純化wCD4蛋白,免疫兔子制備wCD4的多克隆抗體,鑒定抗體的效價(jià)和特異性。 6.原核表達(dá)純化的wCD4蛋白以Al(OH)3佐劑化,常規(guī)免疫Balb/c小鼠。通過細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0和免疫后的小鼠脾細(xì)胞融合,用免疫原蛋白包被板子經(jīng)ELISA方法進(jìn)行初篩。經(jīng)真核表達(dá)質(zhì)粒CD4轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后做免疫熒光復(fù)篩。得到的陽性克隆,通過三次有限稀釋法,篩選出穩(wěn)定分泌anti-wCD4的雜交瘤細(xì)胞。收集雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液,采用ELISA方法測定單克隆抗體Ig亞類。用雜交瘤細(xì)胞制備小鼠腹水。測定腹水和培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià)。將小鼠腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨純化。 7.采用ELISA, Western blot, IF對wCD4單克隆抗體進(jìn)行特異性的鑒定。 8.用wCD4采用Western blot, IF, IHC的方法檢測旱獺PBMC和肝內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞。 9.采用MTT法和CFSE法檢測小鼠脾細(xì)胞和旱獺PBMC細(xì)胞的增 結(jié)果 1.獲得土撥鼠CD4分子全長序列共1359bp,核苷酸序列與人、猩猩、兔、貓、豬、狗、小鼠、大鼠、鴨、雞的同源性分別為76.00%、75.33%、73.13%、72.39%、71.29%、71.15%、69.09%、69.31%、53.89%、52.79%。 2.獲得旱獺CD4胞外段序列,和土撥鼠CD4分子比對,核苷酸同源性99.6%。 3.通過種系發(fā)生分析,發(fā)現(xiàn)旱獺和土撥鼠高度同源。 4. RT-PCR法檢測旱獺WHV感染后,肝內(nèi)CD4 mRNA在感染后第二周有表達(dá)高峰。提示W(wǎng)HV感染后,CD4在早期就開始活化。為以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了CD4阻斷的時(shí)間點(diǎn)。 5.成功構(gòu)建土撥鼠CD4的原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌,經(jīng)過大量誘導(dǎo)表達(dá)純化獲得目的蛋白。用純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得高效價(jià)的特異性多克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA), Western blot,免疫熒光檢測,抗體的靈敏度和特異性均較高.為以后的單克隆抗體制備提供了篩選依據(jù)。 6.獲得四株可穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的細(xì)胞,命名為G1；G2；C9；C10。所分泌單克隆抗體均屬IgG1亞類。經(jīng)持續(xù)6個(gè)月培養(yǎng),低血清適應(yīng)以及反復(fù)凍存與復(fù)蘇后,仍能保持其穩(wěn)定的細(xì)胞增殖和抗體分泌能力。細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)為103-104,腹水中抗體效價(jià)為107-108。 7.采用Western blot, IF的方法,該四株單克隆抗體均能識(shí)別真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1-wCD4轉(zhuǎn)染BHK后表達(dá)的wCD4分子。因?yàn)樵撍闹昕贵w都可以用于WBIF的檢測,所以推斷該四株抗體識(shí)別的應(yīng)為CD4分子天然構(gòu)象中的線性表位。 8.采用IF, IHC的方法,該四株抗體均能識(shí)別旱獺PBMC中的CD4+T細(xì)胞。 9.采用IHC的方法,發(fā)現(xiàn)旱獺WHV感染后,第五周肝內(nèi)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞浸潤明顯增加。 10.成功建立小鼠和旱獺流式檢測細(xì)胞增值試驗(yàn)的方法。為以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)論 1.成功克隆出土撥鼠CD4全長和旱獺CD4部分序列,經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)他們的同源性99.6%。旱獺種系發(fā)生分析結(jié)果顯示中國旱獺和土撥鼠高度同源。為進(jìn)一步在土撥鼠、旱獺動(dòng)物模型中研究WHV和免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 2.成功制備了特異性的高效價(jià)抗woodchuck CD4多克隆抗體。該多克隆抗體可以檢測到真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1-wCD4轉(zhuǎn)染BHK后細(xì)胞表面表達(dá)的wCD4.為下一步的單抗篩選奠定基礎(chǔ)。 3.成功制備了四株能分泌抗土撥鼠CD4的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。該四株單抗均能識(shí)別轉(zhuǎn)染表達(dá)的土撥鼠CD4分子。該四株單抗均能識(shí)別旱獺PBMC的CD4+T細(xì)胞。 4.通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法和wCD4單抗免疫組化的方法均檢測到旱獺感染早期,CD4+T細(xì)胞在肝內(nèi)開始活化增殖。為以后的CD4體內(nèi)阻斷試驗(yàn)提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2387496