【摘要】： 目的:通過(guò)本研究對(duì)上海HIV-1分離株vif基因及蛋白的結(jié)構(gòu)深入了解;體外重組HIV-1Vif蛋白、制備Vif的鼠多克隆抗體并構(gòu)建Vif慢病毒載體感染細(xì)胞模型為進(jìn)一步研究利用RNAi技術(shù)干擾Vif表達(dá),論證以Vif入手進(jìn)行HIV-1干預(yù)的基因治療可行性。研究方法:利用RT-PCR法體外擴(kuò)增上海HIV-1分離株vif基因,通過(guò)測(cè)序并與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)HIV-1分離株比較分析上海HIV-1分離株vif基因的突變率,并導(dǎo)出氨基酸變異情況;進(jìn)一步構(gòu)建vif基因pET32b(+)原核表達(dá)載體,利用BL21 star(DE3)(pLysS)細(xì)胞系表達(dá)并純化Vif蛋白,以純化的Vif蛋白免疫小鼠制備其鼠多克隆抗體,以ELISA法檢測(cè)重組的Vif蛋白及其多克隆抗體的功能;構(gòu)建HIV-1Vif慢病毒表達(dá)載體,感染HEK293T細(xì)胞及正常人PBMC細(xì)胞,并以Real-Time PCR法和SDS-PAGE檢測(cè)vif基因和Vif蛋白的表達(dá)。結(jié)果:本研究數(shù)據(jù)證實(shí)上海HIV-1分離株vif基因與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)HIV毒株比較存在較高突變率,但在150bp～245bp(579bp)之間存在有相對(duì)保守的堿基序列,Vif蛋白的氨基酸存在一定的變異規(guī)律,這些氨基酸變異位點(diǎn)是否影響Vif的功能還不十分清楚,有待于進(jìn)一步研究:本研究重組、表達(dá)的HIV-1Vif蛋白,并成功制備了其多克隆抗體,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AIDS患者血清標(biāo)本中不存在或僅存在少量的HIV-1Vif抗體,在HIV-1感染者體內(nèi)的檢測(cè)價(jià)值還可以進(jìn)一步研究;本研究成功構(gòu)建了表達(dá)Vif蛋白的慢病毒載體感染正常人PBMC細(xì)胞模型及HEK293T細(xì)胞模型。結(jié)論:基于HIV-1Vif在HIV-1發(fā)病過(guò)程中的重要性,對(duì)其基因及蛋白的深入研究,能夠找到HIV感染/AIDS基因治療的新手段,本研究對(duì)HIV-1vif基因序列的研究,找到相對(duì)保守的序列供RNAi作用靶序列選擇;制備的Vif鼠多克隆抗體可用于Vif蛋白的檢測(cè);同時(shí)構(gòu)建了Vif干擾細(xì)胞模型,可用于進(jìn)一步的深入研究。
[Abstract]:Objective: to understand the structure of vif gene and protein in Shanghai HIV-1 isolate. In vitro recombinant HIV-1Vif protein was used to prepare mouse polyclonal antibody against Vif and to construct Vif lentivirus vector infected cell model to further study the interference of Vif expression with RNAi technique and to demonstrate the feasibility of HIV-1 intervention with Vif. Methods: the vif gene of Shanghai HIV-1 isolate was amplified by RT-PCR method in vitro. The mutation rate of vif gene of Shanghai HIV-1 isolate was analyzed by sequencing and comparing with international standard HIV-1 isolate, and the variation of amino acid was deduced. The prokaryotic expression vector of vif gene pET32b () was further constructed, and the Vif protein was expressed and purified by BL21 star (DE3) (pLysS) cell line). The mouse polyclonal antibody was prepared by immunizing mice with purified Vif protein. The function of recombinant Vif protein and its polyclonal antibody was detected by ELISA assay. HIV-1Vif lentivirus expression vector was constructed to infect HEK293T cells and normal PBMC cells. The expression of vif gene and Vif protein was detected by Real-Time PCR and SDS-PAGE. Results: the data of this study confirmed that the vif gene of Shanghai HIV-1 isolate had a higher mutation rate than that of international standard HIV strain, but there was a relatively conserved base sequence between 150bp~245bp (579bp). The amino acids of Vif protein have a certain variation rule. It is not clear whether these amino acid mutation sites affect the function of Vif, and need to be further studied: in this study, the recombination of HIV-1Vif protein, the expression of HIV-1Vif protein, The polyclonal antibody was successfully prepared, and it was confirmed by experiments that there was no or only a small amount of HIV-1Vif antibody in the serum samples of AIDS patients. The detection value of HIV-1Vif antibody in HIV-1 infected patients could be further studied. In this study, we successfully constructed the human PBMC cell model and HEK293T cell model infected with lentivirus vector expressing Vif protein. Conclusion: based on the importance of HIV-1Vif in the pathogenesis of HIV-1, a new method of gene therapy for HIV infection / AIDS can be found by studying its gene and protein. The sequence of HIV-1vif gene was studied in this study. A relatively conservative sequence was found for the selection of target sequences by RNAi. The Vif mouse polyclonal antibody can be used for the detection of Vif protein, and the Vif interference cell model is constructed, which can be used for further study.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2387263