【摘要】： 目的 間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層,具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入和自我復制等特點的一類細胞,在體內或體外特定的誘導條件下,可分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪、內皮等多種表型組織細胞,傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能,可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。MSCs多取材于骨髓,屬侵襲性取材,制約其應用于臨床。臍帶血(umbilical cord blood, UCB)是胎兒娩出、臍帶結扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液,含有豐富的干細胞,臨床常采集臍帶血中造血干細胞用于治療血液類疾病。最近幾年來有研究表明,臍帶血中也存在MSCs[2]。由于臍帶血來源豐富,采集方便,排斥小,無倫理爭議等優(yōu)點,臍血來源MSCs作為移植用細胞越來越受到重視。 臍帶血MSCs缺少特異性表面標志物,此類細胞表達CD29、CD44、CD73、CD90和HLA-ABC, CD 105和CD106,不表達CD14、CD34、CD45、CD133和HLA-DR,并可分化為成骨、軟骨、成脂和成肌樣細胞。有學者應用流式細胞學單管多色染色技術分析臍帶血內MSCs的數(shù)量,每百萬個有核細胞當中含有8.8±4.3個MSCs細胞,而骨髓樣本當中每百萬個有核細胞當中含有13.2±5.8個MSC細胞。分析了臍血MSCs表面抗原表達情況,建立了應用流式細胞學單管多色染色分析臍帶血內MSCs數(shù)量的方法。有報道說臍帶血中MSCs數(shù)量變化較大.臍帶血中MSCs的數(shù)量能有多少,隨著胎兒成熟,其數(shù)量是否發(fā)生變化,]MSCs體外培養(yǎng)其生長速度如何,培養(yǎng)的成功率如何,臍帶血中MSCs在胎兒發(fā)育中是扮演了什么樣的角色,發(fā)揮了怎樣的作用都是值得探討的問題。本實驗應用單管多色熒光染色技術分析了不同胎齡臍帶血中CD44、CD105陽性而CD34、CD45陰性細胞的數(shù)量,以比較不同胎齡臍帶血中MSCs數(shù)量的差別,并分析臍帶血成功培養(yǎng)出MSCs的影響因素,比較不同胎齡臍帶血獲得的MSCs的生長特性,為進一步探討臍帶血MSCs生物學特性打下基礎。 方法 1、單管多色染色行流式細胞學分析臍帶血中MSCs的數(shù)量 (1)無菌條件下取正常臍帶血52份,胎齡從28周～42周,產(chǎn)婦及胎兒無血液系統(tǒng)疾病及其他影響造血功能的病變, (2)每份各取適量血進行單管多色染色行流式細胞學分析, (3)比較不同胎齡臍帶血中MSCs的數(shù)量。 2、培養(yǎng) (1)無菌條件下取37周～40周臍帶血12份,28周～36周臍帶血12例,用含抗凝保護液的采血袋抽取,分別作為足月組和非足月組。 (2)每組各例分別取適量血進行單管多色染色行流式細胞學分析 (3)將臍血稀釋后,直接用Ficoll分離單個核細胞,采用含10%血清濃度的L-DMEM常規(guī)間充質干細胞貼壁培養(yǎng)； (4)對貼壁細胞類型、生長速度進行觀察記錄； (5)對各組成功培養(yǎng)出間充質干細胞的例數(shù)進行統(tǒng)計分析； (6)對分離出的臍血間充質干細胞進行鑒定。 3、統(tǒng)計學分析。 結果 1、流式細胞學結果：52例臍帶血中CD44(+)、CD105(+)/CD34(-)、CD45(-)細胞在10例28周～30周臍帶血中的數(shù)量為15±0.2個／百萬有核細胞；在12例31周～33周臍帶血中為11±0.3個／百萬有核細胞；在10例34周～36周臍帶血中為10±0.1個／百萬有核細胞；在10例37周～39周臍帶血中為6±0.5個／百萬有核細胞；在10例40周～42周臍帶血中,為2±0.3個／百萬有核細胞�？梢婋S胎齡增加,檢測到的MSC數(shù)量減少。 在用來培養(yǎng)的臍帶血足月組中CD44(+)、CD105(+),而CD34(-)、CD45(-)的細胞數(shù)量為6.2±0.2個／百萬有核細胞,非足月組為10.3±0.2個／百萬有核細胞,兩組間存在顯著性差異(P0.01)。 2、足月組與非足月組間充質干細胞生長特性比較 足月組單個核細胞培養(yǎng)96小時后貼壁細胞均出現(xiàn)梭形纖維狀的細胞和圓形細胞兩種形態(tài)細胞,傳代后有1／12份臍血出現(xiàn)旋渦狀排列的間充質樣的細胞,其余11／12份傳代后只有少量梭形細胞混雜,胰酶難以消化下來,最終老化死亡。非足月組單個核細胞培養(yǎng)72小時后,貼壁細胞多為纖維狀的間充質樣細胞,傳代后3／12份臍帶血分離出了間充質樣梭形細胞,且生長速度明顯快于足月組。 3、臍血分離培養(yǎng)間充質干細胞成功率 足月組分離培養(yǎng)間充質千細胞總的成功率為8.3%,非足月組為25.0%。 4、對分離出的臍血MSCs進行鑒定 兩組培養(yǎng)所獲得梭形細胞免疫細胞化學染色檢測MSCs標志物表達：CD45(-),CD90(+)。 結論 1、臍帶血中含有MSCs,隨胎齡增加數(shù)量減少； 2、非足月產(chǎn)臍帶血間充質干細胞接種成功率高于足月產(chǎn)臍帶血的接種成功率； 3、非足月產(chǎn)臍帶血間充質干細胞生長速度快于足月產(chǎn)臍帶血間充質干細胞生長速度。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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