【摘要】： 目的探討人臍帶間充質干細胞分離、培養(yǎng)的方法,研究其基本生物學特性。初步探討人臍帶間充質干細胞向肝樣細胞誘導分化的方法。 方法無菌條件下收集剖宮產新生兒臍帶,利用PBS沖洗臍動脈及臍靜脈,將血液沖洗盡,將其剪碎至1mm~3后,加入Ⅳ型膠原酶(0.1%)消化60min,然后加入胰酶(0.125%)消化30min,利用濾網過濾后收集細胞,DMEM(5%FBS)重懸細胞接種于培養(yǎng)瓶內進行原代培養(yǎng),待細胞生長至80-90%融合后進行1:3傳代培養(yǎng),取傳代培養(yǎng)細胞進行形態(tài)學觀察、免疫細胞化學染色、流式細胞儀檢測、生長活性、細胞周期分析、染色體數目分析及軟瓊脂克隆形成實驗。進一步取第6代細胞經胰酶消化后接種于12孔板中,待細胞生長至約70%融合后,利用兩步誘導法進行誘導,對照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導組中加入0.5μM/L地塞米松,50 g/L ITS,20μg/L HGF,10μg/L FGF4,煙堿0.61g/L,共10天。后期加入20μg/L OSM,0.5μM/L地塞米松,50 g/LITS。每3d換液1次,在不同誘導階段收集細胞后觀察細胞形態(tài),免疫細胞化學,RT-PCR,糖原染色。 結果利用膠原酶及胰酶兩步消化法能充分消化臍帶,細胞易于獲得,收集細胞后進行原代培養(yǎng),24小時可觀察到貼壁細胞,待生長至10天時可見細胞長滿瓶底,進行傳代培養(yǎng),每周傳代1次。觀察細胞形態(tài)為長梭形,不規(guī)則形,細胞大小不一,類似成纖維細胞,呈漩渦樣生長。取第6-9代細胞行免疫細胞化學染色結果顯示細胞強表達CD105、Vimentin,基本不表達CD34、CD31、CD133。經流式細胞儀檢測表達CD29、CD49、CD105,基本不表達造血細胞標志CD34。MTT實驗顯示細胞倍增時間為22h。細胞周期分析表明75%-85%細胞處于G_0/G_1。染色體分析可見細胞染色體條數正常。在軟瓊脂中無克隆形成。經誘導后的細胞在培養(yǎng)到第14d可見細胞形態(tài)出現(xiàn)變化,細胞長突起逐漸消失,逐漸轉為圓形或卵圓形,經免疫組化檢測可見細胞在第1周開始表達AFP,第2周時CK18、CK19、OV6的表達被觀察到。在誘導第3周時ALB表達被觀察到,AFP表達逐漸減弱。到第4周AFP的表達基本消失,ALB的表達增強。RT-PCR結果顯示細胞于第1周開始表達AFP,至誘導后期,AFP表達水平逐漸降低。于第3周時觀察到ALB表達,隨時間延長ALB表達逐漸增強。于第4周糖原染色呈陽性結果。 結論:經酶消化法可從臍帶中獲得間充質干細胞,易于獲得,體外增殖能力強,與骨髓來源間充質干細胞的免疫表型相一致,符合間充質干細胞基本的生物學特性,有望在干細胞的研究及臨床應用方面發(fā)揮重要的作用。臍帶間充質干細胞在本實驗誘導條件下可轉化為肝樣細胞,表達肝細胞的表面標志,初步具備肝細胞特有的功能性特征,將為肝細胞組織工程提供理想的細胞來源。
[Abstract]:Objective To study the isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to study its basic biological characteristics. The method of inducing differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells to liver-like cells was discussed. Methods The umbilical cord of the newborn was collected under aseptic condition. The umbilical artery and the umbilical vein were washed with PBS. The blood was washed with PBS. The umbilical vein and the umbilical vein were washed. After the blood was cut to 1mm ~ 3, type 鈪，

本文編號：2326687