本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞 + 視黃酸��； 參考：《天津科技大學》2010年碩士論文

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有取材方便、來源廣泛、自體移植無免疫排斥性等優(yōu)點而成為理想的移植細胞。成功誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞,對臨床上治療神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復具有重要意義。本研究探討體外分離培養(yǎng)、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,對視黃酸(Retinoic Acid, RA)抑制骨髓間充質(zhì)干細胞增殖,促進其向神經(jīng)細胞分化及作用機制進行初步研究。 通過密度梯度離心培養(yǎng)法和完全貼壁培養(yǎng)法,分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,證實通過離體培養(yǎng),可使體內(nèi)環(huán)境下低豐度的BMSCs實現(xiàn)數(shù)目擴增,發(fā)現(xiàn)密度梯度離心法有利于BMSCs的純化。 不同濃度RA誘導BMSCs,加入堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)優(yōu)化誘導條件,對其進行形態(tài)學觀察,MTT法測定細胞存活率,確定RA最佳誘導濃度。RT-PCR及免疫細胞化學對誘導后的細胞進行鑒定,證實視黃酸誘導BMSCs分化為神經(jīng)細胞,細胞表達神經(jīng)細胞特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GAFP)和微管相關蛋白-2(MAP-2),同時發(fā)現(xiàn)bFGF可以明顯提高BMSCs存活率和保護分化后的神經(jīng)細胞,但是對于BMSCs的分化率無明顯作用。 RT-PCR檢測RA誘導BMSCs過程中,RA受體RXRa的表達上調(diào),證明RXRa參與RA誘導的BMSCs向神經(jīng)細胞分化的過程。 同時檢測到在mRNA水平上轉(zhuǎn)錄因子Myocardin和MRTFA的表達升高,證明Myocardin和MRTFA也參與RA誘導的BMSCs向神經(jīng)細胞分化的過程。利用Myocardin缺失轉(zhuǎn)錄激活域的真核表達質(zhì)粒Myocardin△C,通過競爭性的抑制內(nèi)源Myocardin的功能,研究Myocardin在RA誘導BMSCs分化為神經(jīng)細胞中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Myocardin功能缺失時,RA誘導效率顯著降低,證明RA誘導BMSCs向神經(jīng)細胞分化過程部分依賴轉(zhuǎn)錄因子Myocardin. RT-PCR檢測細胞周期相關蛋白Cyclin-El和P21的表達情況。結(jié)果顯示,在mRNA水平上,細胞周期蛋白cyclin-El的表達下降,P21的表達升高。證明在一定濃度范圍內(nèi),RA能通過下調(diào)細胞周期蛋白Cyclin-El的表達,上調(diào)細胞周期抑制蛋白P21的表達,抑制BMSCs的增殖,促進其分化。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have many advantages, such as convenient material selection, wide source, no immune rejection and so on. The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells is of great significance in the treatment of neurodegenerative diseases and the repair of central nervous system injury. The aim of this study was to investigate the method of isolation and purification of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from SD rats in vitro. Retinoic acid (RA) inhibited the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and promoted their differentiation into neural cells. Rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated and purified by density gradient centrifugation and complete adherent culture. It was proved that the low abundance BMSCs could be amplified by in vitro culture. It was found that density gradient centrifugation was beneficial to the purification of BMSCs. Different concentrations of RA were used to induce BMSCs, then basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor,) was added to optimize the induction conditions, and the cell survival rate was determined by morphological observation. The best concentration of RA was determined. RT-PCR and immunocytochemistry were used to identify the cells induced by retinoic acid, which confirmed that BMSCs were differentiated into nerve cells by retinoic acid. The cells expressed neuronal specific enolase (NSE), glial fibrillary acidic protein (GAFP) and microtubule-associated protein 2 (MAP-2). However, there was no obvious effect on the differentiation rate of BMSCs. RT-PCR was used to detect the up-regulation of RXRa receptor in RA induced BMSCs, which proved that RXRa was involved in the differentiation of BMSCs into neural cells induced by RA. At the same time, the expression of transcription factors Myocardin and MRTFA were increased at mRNA level, which suggested that Myocardin and MRTFA were also involved in the differentiation of BMSCs into neural cells induced by RA. The role of Myocardin in the differentiation of BMSCs into nerve cells induced by RA was studied by competitive inhibition of endogenous Myocardin using Myocardin deletion transcription activation domain eukaryotic expression plasmid Myocardin C. The results showed that the induction efficiency of RA was significantly decreased in the absence of Myocardin, which indicated that the differentiation process of BMSCs induced by RA was partly dependent on the transcription factor Myocardin.RT-PCR was used to detect the expression of cyclin El and P21. The results showed that the expression of cyclin-El decreased and the expression of P21 increased at mRNA level. The results showed that RA could down-regulate the expression of cyclin-El, up-regulate the expression of cell cycle inhibitor protein P21, inhibit the proliferation of BMSCs and promote the differentiation of BMSCs.
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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