本文選題：硫化氫　切入點(diǎn)：硫氫化鈉　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：硫化氫(Hydrogen Sulfide, H2S)是一種無色有臭雞蛋味的氣體,過去一直被認(rèn)為是毒性氣體。但是,近年來研究發(fā)現(xiàn)多種哺乳動物細(xì)胞自身能產(chǎn)生H2S,在正常大鼠的血液中H2S濃度達(dá)到46μmol/L,在腦中H2S濃度高達(dá)100μmol/L。內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚-p-合酶(Cystathionine β-synthase, CBS)或胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine γ-lyase, CSE)分解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,而CSE主要存在于心血管系統(tǒng)中。內(nèi)源性H2S對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均有重要的生理調(diào)節(jié)功能。由于H2S是一種小分子量的氣體分子,能穿透細(xì)胞膜直接起效,在體內(nèi)產(chǎn)生并受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié),生理濃度時有明確的功能并能被外源性氣體模擬,因此,H2S成為繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三個氣體信號分子。H2S在正常血壓的維持和調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。研究顯示,內(nèi)源性H2S水平的降低與高血壓的形成有密切關(guān)系,而給予補(bǔ)充外源性H2S有降壓效果,能緩解高血壓的進(jìn)程。腎臟是參與整體血壓調(diào)節(jié)的重要器官,它具有調(diào)節(jié)機(jī)體水鈉平衡的功能,對正常血壓的維持和調(diào)節(jié)有著重要意義。當(dāng)腎臟的水鈉重吸收功能發(fā)生障礙時,機(jī)體的血壓會明顯升高。近年來,鹽與高血壓的密切關(guān)系已逐漸引起人們的重視。高鹽的攝入會影響正常生理狀態(tài)下鈉的動態(tài)平衡,會直接導(dǎo)致腎臟水鈉潴留,引起高血壓。由此可見,腎臟水鈉排泄障礙和水鈉潴留是高血壓形成的重要機(jī)制,多年來排鈉利尿劑也已成為臨床上治療高血壓病的有效藥物,因此,研究腎臟水鈉排泄的調(diào)節(jié)具有重要的臨床應(yīng)用價值。在腎臟組織中,含有豐富的催化內(nèi)源性H2S產(chǎn)生的酶CBS和CSE,它們主要位于腎皮質(zhì)近端小管。而腎臟調(diào)節(jié)水鈉排泄的主要部位就在腎皮質(zhì)近端小管,已知約有70%的水和鈉是在近端小管被重吸收的,因此提出H2S有可能影響腎臟水鈉排泄的設(shè)想。然而目前H2S在腎臟組織中的生理功能還不十分清楚,僅在2009年有一篇文獻(xiàn)報(bào)道H2S可能參與腎組織血流動力學(xué)和排泄方面的功能調(diào)節(jié)。因此,本文通過對H2S在腎臟水鈉排泄方面的研究,將更深入地認(rèn)識這個新的氣體信號分子。首先,觀察H2S對正常SD大鼠腎臟水鈉排泄的作用。實(shí)驗(yàn)中,使用硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的供體,選擇一分鐘勻速靜脈注射的方式,盡量保持平均動脈壓(MAP)和腎動脈血流量(RBF)的穩(wěn)定,使其不會直接影響腎臟水鈉排泄的作用。給予正常SD大鼠一分鐘勻速靜脈注射20μmol/kg的NaHS,檢測其尿量(UV)、排鈉量(UNaV)、排鉀量(UKV)和排氯量(UClN),結(jié)果顯示H2S能促進(jìn)正常SD大鼠的腎臟排鈉排鉀,且不伴有腎血流量的改變。其次,觀察H2S對鹽負(fù)荷大鼠腎臟水鈉排泄的作用。通過建立急性鹽負(fù)荷和慢性鹽負(fù)荷兩種大鼠模型,研究在病理狀態(tài)下,H2S能否促進(jìn)水鈉排泄,并緩解高血壓的形成。給予SD大鼠勻速靜脈注射5%NaCl溶液1小時,建立急性鹽負(fù)荷大鼠模型,接著一分鐘勻速靜脈注射不同濃度NaHS (5,10,20,30,60, 90μmol/kg),觀察H2S對其血流動力學(xué)和排泄方面的影響。結(jié)果顯示H2S對MAP、RBF和腎小球?yàn)V過率(GFR)等血流動力學(xué)方面沒有影響,而在排泄方面,10和20μmol/kg的NaHS能促進(jìn)急性鹽負(fù)荷大鼠腎臟排鈉、排鉀和排氯,對尿量沒有影響。之后進(jìn)一步檢測了血漿醛固酮(ALD)和抗利尿激素(ADH)的水平,結(jié)果顯示H2S對這兩種激素的水平?jīng)]有影響。然后,通過皮下注射醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和飼飲鹽水的方法,建立DOCA-Salt高血壓大鼠(DHR)模型作為慢性鹽負(fù)荷大鼠模型。在造模的同時,預(yù)防性(即在血壓沒有升高之前)的給予大鼠腹腔注射不同濃度NaHS (10、30、 60μmol/kg/d)8周,觀察H2S對其MAP和排泄方面的影響。結(jié)果顯示,8周時,H2S能使MAP升高的幅度降低,緩解高血壓的形成；而10μmol/kg的NaHS在4周時能促進(jìn)慢性鹽負(fù)荷大鼠腎臟排水、排鈉、排鉀和排氯。之后同樣檢測第4周時慢性鹽負(fù)荷大鼠血漿ALD和ADH的水平,結(jié)果顯示H2S對這兩種激素沒有影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明H2S能促進(jìn)鹽負(fù)荷大鼠腎臟的水鈉排泄,且不伴有腎血流量、腎小球?yàn)V過率和血漿ALD、ADH的改變,提示H2S促進(jìn)腎臟水鈉排泄的作用部位很可能在腎小管。而在腎小管上影響水鈉重吸收的是離子轉(zhuǎn)運(yùn)體,其中最主要的就是鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase,Na+泵)。因此,通過分離慢性鹽負(fù)荷大鼠的腎小管上皮細(xì)胞和檢測Na+-K+-ATPase的活性,發(fā)現(xiàn)H2S能抑制慢性鹽負(fù)荷大鼠腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的活性。推測H2S通過直接抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的活性,抑制腎小管對Na+的重吸收,從而產(chǎn)生促進(jìn)水鈉排泄的作用。此機(jī)制有待于在細(xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證。另外,通過比較H2S促進(jìn)正常SD大鼠和急慢性鹽負(fù)荷大鼠腎臟排鈉排鉀作用的差別,發(fā)現(xiàn)H2S在病理狀態(tài)下,促進(jìn)排鈉排鉀的作用更強(qiáng),具有一定的臨床意義。為了進(jìn)一步探討H2S促進(jìn)大鼠腎臟水鈉排泄的作用機(jī)制,本文通過分離大鼠腎小管上皮細(xì)胞作原代培養(yǎng),研究H2S是否可直接調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給予NaHHS可直接抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的活性,印證了本文前面的推測,即H2S可直接抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+泵的功能,抑制腎小管對Na+的重吸收,從而產(chǎn)生排鈉利尿作用。那么,H2S是如何抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的呢?通過檢測細(xì)胞cAMP、cGMP、PKA和PKC的活性以及PKA和PKC的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)H2S對它們沒有影響。之后Western blot結(jié)果顯示H2S能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號分子PI3K和Akt的磷酸化,并具有時間和濃度依賴性,用PI3K的阻斷劑LY294002和wortmannin能夠阻斷H2S引起的Akt磷酸化。預(yù)先給予細(xì)胞PI3K的阻斷劑或者用顯性負(fù)表達(dá)的Akt質(zhì)粒(DN-Akt)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,H2S抑制Na+-K+-ATPase的效應(yīng)被阻斷,說明H2S抑制細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的效應(yīng)可能通過PI3K/Akt通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),H2S既能使Na+-K+-ATPase α1亞基發(fā)生酪氨酸磷酸化(Tyr10),也能使ERIK的磷酸化水平增加,提示Na+泵α1亞基和ERK也可能參與H2S對細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的調(diào)控。最后,研究H2S除了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用之外,是否有可能直接與Na+-K+-ATPase結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用呢?選用純化的Na+-K+-ATPase與NaHS直接反應(yīng),結(jié)果顯示,H2S能提高純化Na+-K+-ATPase的活性,并且這種效應(yīng)具有時間和濃度的依賴性,考慮可能的原因是純化Na+-K+-ATPase的組織差異、種屬差異以及構(gòu)象的改變。為了進(jìn)一步探索H2S與Na+-K+-ATPase之間的相互作用,本文通過AutoDock軟件對H2S與Na+-K+-ATPase進(jìn)行分子對接研究。結(jié)果顯示,H2S與Na+-K+-ATPase可能有3個結(jié)合位點(diǎn),其中已知的是K+結(jié)合位點(diǎn),提示H2S可能通過影響K+與Na+-K+-ATPase的結(jié)合而調(diào)節(jié)Na+泵功能。綜上所述,本文通過上述一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2S能促進(jìn)正常SD大鼠和鹽負(fù)荷大鼠腎臟的水鈉排泄；H2S促進(jìn)水鈉排泄的作用是通過抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase來完成的；H2S抑制腎小管上皮細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的活性可能與激活細(xì)胞PI3K/Akt信號通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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7 王e，

本文編號：1614637