本文選題：單克隆抗體　切入點(diǎn)：脂多糖　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 膿毒癥是ICU病人最常見的死亡原因,盡管其醫(yī)療投入巨大,嚴(yán)重膿毒癥的死亡率還是居高不下,可達(dá)25%-30%,而膿毒癥休克的死亡率則更高,達(dá)到了40%-70%。 膿毒癥可由多種病原微生物感染引起,包括革蘭氏陽性(G~+)菌、革蘭氏陰性(G~-)菌和真菌等等,而其中G~-菌感染是最重要的一種,占總發(fā)病人數(shù)的40%以上。脂多糖(LPS)是G~-菌細(xì)胞壁的重要組成成分,也是G~-菌感染膿毒癥中最主要的毒力因子和抗原成分。所以在G~-菌感染引起的膿毒癥的診斷與治療中,LPS是一個(gè)重要的靶點(diǎn)。目前尚無LPS拮抗劑用于臨床應(yīng)用或進(jìn)入臨床觀察,但有證據(jù)顯示,預(yù)存抗LPS抗體與敗血癥的發(fā)生、大樣本住院腫瘤患者、燒傷、外科手術(shù)等因感染死亡的病人數(shù)呈負(fù)相關(guān),即對(duì)LPS誘發(fā)的病理進(jìn)程有明確的保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示針對(duì)LPS的單克隆抗體(mAb)對(duì)實(shí)驗(yàn)性膿毒癥動(dòng)物模型具有良好的保護(hù)作用。所以,抗LPS的mAb有可能成為治療G~-菌感染誘發(fā)的膿毒癥的一種新制劑。 LPS由三部分組成:O特異性抗原,也叫O抗原或體抗原,位于G~-菌細(xì)胞壁的最外面,由一長鏈多糖構(gòu)成;核心寡糖,是一由大約10個(gè)左右的單糖組成的寡糖;類脂A。所以,脂多糖是一結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、具有多種異質(zhì)性的生物大分子,而且屬于胸腺非依賴抗原(TI)抗原。與蛋白質(zhì)等胸腺依賴(TD)抗原不同,TI抗原不能誘導(dǎo)抗體親和成熟,也不能誘導(dǎo)免疫記憶,所以按常規(guī)的免疫方法很難產(chǎn)生高親和力、交叉反應(yīng)性抗LPS的mAb。為解決此難題,一個(gè)可行的方法就是用分子模擬技術(shù),即用蛋白質(zhì)、多肽來模擬LPS的抗原結(jié)構(gòu),從而將多糖類TI抗原轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚯念怲D抗原,提高抗原的免疫原性。那么,篩選出能夠模擬LPS抗原結(jié)構(gòu)的多肽就成為其中關(guān)鍵的一步。 噬菌體展示技術(shù)是一種用于篩選和改造功能性短肽和蛋白質(zhì)強(qiáng)有力的生物技術(shù),廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。事實(shí)上,噬菌體展示技術(shù)早已成功的應(yīng)用于多糖表位的模擬肽篩選,如對(duì)腦膜炎奈瑟球菌A、B、C三種血清型的莢膜多糖的模擬肽篩選。這些結(jié)果說明,用噬菌體展示技術(shù)可以篩選出模擬多糖抗原表位的模擬肽,從而將TI抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門D抗原,誘導(dǎo)強(qiáng)而有力的記憶性免疫應(yīng)答,制備出高親和力、交叉反應(yīng)性抗LPS的mAb。 所以,本課題的主要研究思路是:利用噬菌體展示技術(shù)篩選并合成模擬LPS保守抗原表位的多肽,將其抗原表位的化學(xué)性質(zhì)由脂多糖改變?yōu)槎屉?由此使TI抗原改變?yōu)門D抗原;然后將多肽與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行交聯(lián),用交聯(lián)物作為免疫原免疫BALB/c小鼠,制備具有高親和力、廣泛交叉反應(yīng)性的抗LPS的mAb。最后對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)、外的保護(hù)活性進(jìn)行初步探討。 本課題組在前期工作中,以具有交叉保護(hù)活性的抗鼠傷寒沙門氏菌多克隆抗體為配基成功的從噬菌體環(huán)七肽庫中篩選到四個(gè)可模擬LPS表位的保守序列,其免疫原性和抗原性已通過一系列實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。其中一個(gè)模擬肽經(jīng)加入延長序列被命名為13L,我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示,用13L交聯(lián)藍(lán)載體(BC)作為免疫原免疫BALB/c小鼠后,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)G~-菌感染和內(nèi)毒素休克的保護(hù)作用。以這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),本實(shí)驗(yàn)選擇13L作為候選模擬肽,交聯(lián)BC后免疫BALB/c小鼠,制備抗LPS的單克隆抗體。本研究包括以下兩個(gè)部分: 一、抗脂多糖單克隆抗體的制備及鑒定 模擬肽13L的篩選與合成按照本課題組以前建立的方法進(jìn)行,現(xiàn)簡述如下:以大腸桿菌LPS L2630為配體用親和層析法從抗鼠傷寒沙門氏菌兔血清中純化出抗LPS的多克隆抗體;以純化的多克隆抗體為配體從環(huán)七肽庫中篩選出模擬LPS抗原表位的多肽,其中的一個(gè)親和力較強(qiáng)的多肽被命名為L7;為了增加L7的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,我們?cè)谄浒被嵝蛄袃蓚?cè)各加入兩個(gè)額外的氨基酸,并命名為13L,然后交由生物公司進(jìn)行合成。 由于短肽分子量過低而不具備免疫原性,遂將其與藍(lán)載體通過交聯(lián)劑EDC的作用而進(jìn)行交聯(lián),將交聯(lián)物13L-BC作為本次實(shí)驗(yàn)的免疫原。 用13L-BC免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,共免疫7次,免疫程序如下:第1次免疫,將13L-BC與福氏完全佐劑(CFA)充分乳化后,小鼠足墊、皮下多點(diǎn)注射,1mg/ml,100μl/只,3周后進(jìn)行第二次免疫;第2-5次免疫,將13L-BC與福氏不完全佐劑(IFA)充分乳化后,小鼠足墊、皮下多點(diǎn)注射,1mg/ml,100μl/只,每次間隔2周;第6次免疫,將煮沸處理過的大腸桿菌O111:B4和鼠傷寒桿菌直接行小鼠腹腔注射,5×10~6CFU/只;第七次免疫,2周后,小鼠眼眶靜脈采血并包被L2630和L7261用間接ELISA檢測血清中抗LPS抗體的滴度,抗體滴度高的小鼠再尾靜脈注射10μg L2630加強(qiáng)免疫一次。 3天后,處死小鼠,取其脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞融合制備雜交瘤,用L2630和L7261進(jìn)行復(fù)合篩選,對(duì)雙陽性孔進(jìn)行克隆化。連續(xù)三次克隆化100%陽性后,擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,收集雜交瘤細(xì)胞行小鼠腹腔注射制備腹水,用親和層析法從制備的腹水中純化單克隆抗體。 共融合3次,融合率在60%-100%之間,陽性率在1%-5%之間。通過篩選、克隆化最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗LPS抗體的雜交瘤細(xì)胞,命名為SMU-3A8。包被L2630檢測SMU-3A8的腹水效價(jià)和純化抗體效價(jià),結(jié)果分別為1:1×10~6和8ng/ml。經(jīng)IgG亞類鑒定試劑盒鑒定,SMU-3A8的亞類為IgG2a。用間接ELISA、WesternBlot、Dot-ElISA、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)顯示SMU-3A8可以和四種商品化的LPS反應(yīng),即大腸桿菌O111∶B4型LPS(L2630)、大腸桿菌O127∶B8型LPS(L3880)、鼠傷寒沙門氏菌LPS(L7261)和腸炎沙門氏菌LPS(L6761),其親和力分為4.9×10~8L/mol、1.6×10~7L/mol、4.2×10~8L/mol和1.5×10~7L/mol。并可以和七種G~-菌(大腸桿菌O111∶B4,大腸桿菌O127∶B8,鼠傷寒沙門氏菌,福氏痢疾桿菌,綠膿假單胞菌,結(jié)腸炎耶爾森菌,鼠疫耶爾森菌)的超聲上清及細(xì)菌全菌反應(yīng),但不能和金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌等G~+菌反應(yīng)。說明SMU-3A8是具有廣泛交叉反應(yīng)活性的抗LPS單克隆抗體。 二、抗脂多糖單克隆抗體的體內(nèi)、外保護(hù)活性 在第一部分實(shí)驗(yàn)中,我們已成功的制備了一株能與多種商品化LPS和G~-菌具有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體SMU-3A8。我們用補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)和SMU-3A8對(duì)LPS刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響來檢測其體外活性;用SMU-3A8對(duì)致死量G~-菌感染小鼠存活率的影響以及對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠存活率的影響來檢測其體內(nèi)活性,具體過程如下: 1.補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)菌37℃振蕩培養(yǎng)5小時(shí)后,室溫8000rpm,離心10分鐘,用無菌PBS洗滌三次并調(diào)整細(xì)菌濃度為10~4CFU/ml。然后按體積1∶1的比例加入倍比稀釋的SMU-3A8(初始濃度10μg/ml),轉(zhuǎn)入到96孔培養(yǎng)板中,180μl/孔,加入豚鼠血清,20μl/孔,設(shè)不加抗體及不加補(bǔ)體的空白對(duì)照組。37℃反應(yīng)1小時(shí)后,每孔取出10μl用無菌PBS稀釋20倍至終體積200μl,然后均勻涂布于LB平板上,37℃過夜培養(yǎng),計(jì)數(shù)形成的細(xì)菌集落。 結(jié)果顯示,在補(bǔ)體存在的情況下,SMU-3A8并不能對(duì)金葡菌、大腸桿菌、鼠傷寒菌和痢疾桿菌構(gòu)成殺傷作用。 2.SMU-3A8對(duì)LPS刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7為本實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為10~6個(gè)/ml,加入到24孔培養(yǎng)板中,500μl/孔。然后同時(shí)加入終濃度為10μg/ml的L2630和倍比稀釋的SMU-3A8,設(shè)同型對(duì)照和空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后,收集上清,用NO檢測試劑盒檢測上清中NO的濃度。 結(jié)果顯示,在較高濃度下(≥10μg/ml)SMU-3A8對(duì)L2630刺激RAW264.7產(chǎn)生NO有一定的抑制作用,如在10μg/ml時(shí),其抑制率為20%左右。 3.SMU-3A8對(duì)細(xì)菌感染和內(nèi)毒素休克小鼠模型的保護(hù)作用參照本課題組以前建立的G~-菌感染和內(nèi)毒素休克動(dòng)物模型,并做了適當(dāng)調(diào)整,作為本次實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型。G~-菌過夜培養(yǎng)后用無菌PBS調(diào)整濃度,BABL/c小鼠腹腔注射,使其在4-7天時(shí),死亡率為100%。BALB/c小鼠尾靜脈直接注射LPS來制備內(nèi)毒素休克模型,200μg/只,使其在12-36小時(shí)死亡率為100%。細(xì)菌或LPS注射2小時(shí)前,于小鼠尾靜脈注射不同濃度的SMU-3A8,設(shè)同型對(duì)照和空白對(duì)照。觀察并記錄小鼠的存活情況。 結(jié)果顯示,SMU-3A8在高濃度時(shí)能將鼠傷寒感染小鼠的死亡率從100%降低到75%左右,對(duì)大腸桿菌,痢疾桿菌感染小鼠則沒有保護(hù)作用。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)毒素休克模型也沒有保護(hù)作用。 結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)中,我們用模擬肽模擬LPS的抗原表位并將模擬肽與藍(lán)載體交聯(lián)作為免疫原,成功制備了一株具有交叉反應(yīng)活性的抗LPS mAb SMU-3A8。ELISA,Dot-ELISA,Western Blotting,免疫熒光,流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,SMU-3A8可以和四種商品化的LPS以及七種G~-菌反應(yīng),但不和G~+菌反應(yīng)。體內(nèi)、外保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示,SMU-3A8可以減少L2630刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7產(chǎn)生NO的量,并可以提高鼠傷寒菌感染小鼠的存活率,具有一定的保護(hù)作用。 據(jù)我們所知,還未有用模擬肽制備抗LPS mAb的報(bào)道,我們的實(shí)驗(yàn)為多糖等TI抗原的mAb制備提供了一個(gè)新策略。SMU-3A8具有交叉反應(yīng)性和一定的保護(hù)活性,有可能成為LPS研究的一個(gè)重要的工具,在臨床G~-菌感染的診斷和治療中也可能會(huì)發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 王涵;鐵皮石斛素新成分的分離與功效鑒定[D];吉林大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1596672