本文關鍵詞：共表達GM-CSF和IL-2腺病毒載體的構建及在人骨髓間充質(zhì)干細胞的表達

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【摘要】：[背景]：樹突狀細胞瘤苗是目前最常用的腫瘤特異性T細胞免疫治療策略之一,而腫瘤原位活化樹突狀細胞是本領域一個重要的研究方向,如何將樹突狀細胞和T細胞活化因子運送至腫瘤局部是有待解決的難題之一。利用人骨髓間充質(zhì)干細胞具有腫瘤趨向性和低免疫原性的特性,將樹突狀細胞和T細胞活化因子導入骨髓間充質(zhì)干細胞后運送至腫瘤局部表達可能是解決北述難題的方案之一。 [目的]：構建共表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF).GM-CSF和白介素2(Interleukin-2, IL-2)的5型腺病毒載體(Ad5GM-CSF-IL-2),感染人骨髓間充質(zhì)干細胞,檢測GM-CSF和IL-2的表達水平和持續(xù)時間,為體內(nèi)活化樹突狀細胞和T細胞提供實驗依據(jù)。 [方法]：實驗于2011-6/2012-12在解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院生物治療中心實驗室完成。用淋巴細胞分離液分離人外周血單個核細胞后再用RNA提取試劑盒提取總RNA,以此為模板用RT-PCR方法擴增GM-CSF和IL-2基因cDNA, PCR擴增片段分別插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表達載體中,再利用腦心肌炎病毒內(nèi)部核酸進入位點(Internal ribosomal entry sites, IRES)序列,構建腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515GM-CSF-IRES-IL-2.采用AdMaxTM FLP重組腺病毒載體體系,將穿梭質(zhì)粒pDC515GM-CSF-IRES-IL-2與pBGHfrtΔE1,3FLP骨架質(zhì)粒共轉染至293細胞,通過重組酶位點特異性重組獲得Ad GM-CSF-IL-2。Ad GM-CSF-IL-2以100pfu/細胞的感染復數(shù)感染常規(guī)培養(yǎng)至第三代的人骨髓間充質(zhì)干細胞,2h后,經(jīng)10Gy的γ射線照射使其失去增值能力,分別用GM-CSF和IL-2ELISA試劑盒在不同的時間點檢測細胞上清中GM-CSF和IL-2蛋白的水平。 [結果]：經(jīng)測序證實,克隆獲得的GM-CSF、IL-2cDNA序列分別與GenBank NM000758(435bp)和GenBank NM000586(462bp)提供的序列完全一致。在腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC515的多克隆位點中,通過IRES序列將GM-CSF和IL-2串聯(lián)起來,構成pDC515GM-CSF-IL-2穿梭質(zhì)粒,脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將上述穿梭質(zhì)粒與pBGHfrtΔEl,3FLP腺病毒骨架質(zhì)粒共轉染至293包裝細胞,通過293細胞空斑形成,獲得Ad5GM-CSF-IL-2毒種,凍融裂解后提取DNA,分別用GM-CSF和IL-2引物鑒定,可獲得兩條與GM-CSF和IL-2基因片段大小一致的片段；毒種反復擴增、CsCl純化獲得1010-1011pfu的病毒滴度。以感染復數(shù)為100pfu/細胞的Ad5GM-CSF-IL-2感染人骨髓間充質(zhì)干細胞,感染12h即可在上清中檢測到兩種細胞因子的表達,至48-96h表達達到高峰,以后表達逐步緩慢地下降,至第7天兩種細胞因子仍然有較高的表達。 [結論]：用AdMaxTM FLP重組腺病毒載體可高效、快捷地獲得所要包裝的腺病毒載體,通過IRES連接GM-CSF和IL-2兩個基因,均獲得高效表達。AdGM-CSF-IL-2感染人骨髓間充質(zhì)干細胞后可連續(xù)7天高水平的分泌GM-CSF和IL-2。以人骨髓間充質(zhì)干細胞為載體細胞傳送GM-CSF和IL-2的肺瘤面免疫治療有潛在的應用前景。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1190003