本文關(guān)鍵詞：皮層細胞低氧條件液對神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究

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【摘要】：研究目的 本研究旨在分析大鼠大腦皮層細胞不同低氧濃度條件液對神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)增殖和分化的影響，并探討PI3-K和JNK這兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此過程中發(fā)揮的作用。研究方法 本研究主要分為五個部分：⑴低氧條件液的制備。分離新生24h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層細胞并進行原代培養(yǎng)，，以密度(6.5 7.0)×105細胞/ml，接種于預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的24孔板中，培養(yǎng)5d后進行全量換液，并放入4%O2、1%O2和常氧濃度(20.96%O2)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)細胞6h以制備低氧條件液和常氧條件液。⑵觀察和分析低氧條件液對NSCs增殖的影響。分離生后24h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層NSCs，以密度(6.0 6.5)×105細胞/ml接種于48孔板中。實驗組用低氧條件液培養(yǎng)，對照組用常氧條件液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后計數(shù)神經(jīng)球，以分析NSCs的增殖效率，分別于培養(yǎng)24h、48h和72h三個時間點測量神經(jīng)球直徑，以分析NSCs的增殖速度；72h后進行Nestin免疫熒光染色鑒定。⑶觀察和分析低氧條件液對NSCs分化的影響。NSCs分離于生后24h內(nèi)SD大鼠大腦皮層，用Neurobasal培養(yǎng)基添加2%B27和20ng/ml bFGF懸浮培養(yǎng)，48h后獲得NSCs增殖形成的神經(jīng)球，將其轉(zhuǎn)接到預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的48孔板中，待神經(jīng)球完全貼壁后進行全量換液誘導(dǎo)NSCs分化。實驗組用低氧條件液培養(yǎng)，對照組用常氧條件液培養(yǎng)。48h后使用免疫熒光雙標法鑒定NSCs后代細胞表型，并分別計算每種表型細胞在后代細胞中所占的比例，以分析不同條件下NSCs的分化情況。⑷分析4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對NSCs增殖的影響。NSCs分離方法同⑵，實驗分為四組：①低氧條件液組；②DMSO組(向低氧條件液中添加DMSO，其終濃度為0.5%)；③LY294002組；④SP600125組。兩種抑制劑使用前均用DMSO溶解，以10μmol/L終濃度加入低氧條件液中，DMSO終濃度為0.5%。細胞培養(yǎng)方法及神經(jīng)球計數(shù)和直徑測量方法均同⑵。⑸分析4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對NSCs分化的影響。NSCs分離方法、細胞培養(yǎng)及計數(shù)方法均同⑶，實驗分組方法同⑷。⑵⑶⑷中每組均設(shè)3個復(fù)孔，細胞置于37℃、5%CO2、95%空氣的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，實驗重復(fù)3次。 研究結(jié)果 1．低氧條件液對NSCs增殖的影響：①4%低氧條件液組和常氧條件液組NSCs的增殖效率高于1%低氧條件液組(P0.01)，但前兩者之間沒有差異；②與常氧條件液組相比，兩個低氧條件液組均提高了NSCs的增殖速度(P0.01)，且4%低氧條件液NSCs的增殖速度較1%低氧條件液快(P0.01)。 2．低氧條件液對NSCs分化的影響：在三種條件液培養(yǎng)下NSCs分化出神經(jīng)元的比例均高于星形膠質(zhì)細胞的比例；與常氧條件液組比較，4%低氧條件液促進了NSCs向神經(jīng)元方向分化(P0.01)，而1%低氧條件液則抑制了NSCs向神經(jīng)元細胞方向分化(P0.01)。 3．4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對NSCs增殖的影響：在4%低氧條件液中使用LY294002和SP600125同時抑制了NSCs的增殖效率和增殖速度，且LY294002抑制作用在24h之后尤為明顯。 4.4%低氧條件液中抑制劑LY294002和SP600125對NSCs分化的影響：在4%低氧條件液中使用LY294002和SP600125均抑制了NSCs向神經(jīng)元方向分化(P0.01)，且LY294002抑制作用較SP600125大(P0.01)。 研究結(jié)論 大腦皮層細胞4%氧濃度的低氧條件液能顯著提高NSCs的增殖速度和促進大腦皮層NSCs向神經(jīng)元方向分化，PI3-K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這兩個過程中均發(fā)揮主要作用。
【學位授予單位】：上海體育學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：1189831