本文關(guān)鍵詞：利用同源模建對蛋白的抗原表位預(yù)測和抑制機理分析

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【摘要】：蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息對于研究蛋白質(zhì)的功能及作用機制具有重要意義,但有些蛋白質(zhì)的結(jié)晶難以獲得,同源模建是解決這一難題的重要手段。與目的蛋白序列同源性大于30%、且已發(fā)表晶體結(jié)構(gòu)的蛋白作為模板。利用同源模建技術(shù)構(gòu)建目的蛋白三維結(jié)構(gòu),從而可以分析蛋白的活性口袋、特異性氨基酸與抑制機理等結(jié)構(gòu)信息。本文主要針對3個不同來源的、且難以結(jié)晶的蛋白質(zhì)酶為研究對象,利用同源模建分別獲得它們的三維結(jié)構(gòu),分析了每個蛋白的特異三維結(jié)構(gòu)信息。 (一)白眉蝮蛇降纖酶的同源模建及B細胞抗原表位預(yù)測 白眉蝮蛇降纖酶是臨床上用來治療血栓栓塞性疾病的國家基本藥物,但該蛋白來源于蛇毒,是異源蛋白,且是分子量大于30KDa的大分子物質(zhì),具有免疫原性,能引起過敏反應(yīng)。本文首先通過DNAStar軟件和ABCpred、BCPREDS等服務(wù)器預(yù)測得到肽端AA27～35、44～50、66～72、79～98、101～109、117～127、134～142、151～164、179～188、194～206、221～233、247～260區(qū)域為白眉蝮蛇降纖酶的B細胞線性表位優(yōu)勢區(qū)域。然后以蝮蛇毒蛋白C激活劑蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為模板,利用MODELLER9.10軟件中的Pythonwin程序進行白眉蝮蛇降纖酶的同源模建,并利用PROCHECK,ERRAT及PROSA程序進行同源模建的合理化評價。根據(jù)白眉蝮蛇降纖酶的模建三維結(jié)構(gòu)并結(jié)合DiscoTope和cons PPISP網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測B細胞構(gòu)象型抗原表位。得到蛋白的N端45～51、81～90、95～106、134～141、153～159、177～182、225～232、251～257區(qū)段為白眉蝮蛇降纖酶的B細胞構(gòu)象型表位區(qū)域。 (二)黃曲霉果膠甲基酯酶的同源模建及其抑制機理分析 黃曲霉果膠甲基酯酶是黃曲霉侵染植物時分泌的關(guān)鍵酶,該酶被認為是植物致病因子之一。植物不分泌抑制該酶的活性物質(zhì),因此該酶的外源抑制劑的研發(fā)可成為抑制黃曲霉污染的有效手段。研究室前期研究發(fā)現(xiàn)綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯Epigallocatechin gallate (EGCG)對重組黃曲霉果膠甲基酯酶的活性有很強的抑制作用,而綠茶中的表沒食子兒茶素(-)-epigallocatechin (EGC)對該酶的抑制效果不明顯。為了更好地了解該酶的分子抑制機理,本文首先以西紅柿果膠甲基酯酶的晶體結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建了黃曲霉果膠甲基酯酶的同源模建。分子對接發(fā)現(xiàn)EGCG能穩(wěn)定地存在于酶的活性口袋里,是因為它可以與活性口袋處的氨基酸殘基Gln122形成強氫鍵作用,還能與活性口袋處的氨基酸殘基Trp228形成π-π堆積作用。另一方面,EGC只與不位于活性口袋的氨基酸殘基發(fā)生氫鍵作用,因此不能覆蓋酶的活性口袋。 (三)人來源趨化因子CCL1的重組制備、同源模建及抑制機理分析 趨化因子CCL1是炎癥、腫瘤及神經(jīng)性疼痛等疾病的關(guān)鍵因子,抑制其活性的化合物可以成為治療這些疾病的候選藥物。本文首先在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了人來源趨化因子CCL1,發(fā)現(xiàn)其形成包涵體。利用6M尿素將蛋白變性,通過親和層析得到電泳純度的重組人來源趨化因子CCL1。然后在含有還原型/氧化型谷胱甘肽的緩沖液中將蛋白復(fù)性。以趨化因子CCLl4的晶體結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建了CCL1的同源模建。通過分子對接和體外活性實驗,篩選出實驗室抑制劑編號為XL-10的小分子化合物具有很好的抑制效果。再通過分子對接發(fā)現(xiàn),抑制劑XL-10可與CCL1的Asn30、Thr31和Ser32氨基酸殘基形成氫鍵作用。
【關(guān)鍵詞】：三維結(jié)構(gòu) 同源模建 分子對接 重組蛋白 B細胞抗原表位 抑制機理
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-13
• 1 文獻綜述13-25
• 1.1 同源模建13-14
• 1.1.1 同源模建簡介13
• 1.1.2 同源模建的基本步驟13-14
• 1.2 分子對接14-16
• 1.2.1 分子對接簡介14-15
• 1.2.2 分子對接的基本步驟15-16
• 1.3 降纖酶及免疫原性16-19
• 1.3.1 降纖酶的臨床應(yīng)用及主要問題16
• 1.3.2 免疫原性16-19
• 1.4 果膠甲基酯酶19-21
• 1.4.1 果膠甲基酯酶概述19-20
• 1.4.2 黃曲霉果膠甲基酯酶抑制劑的研究意義20-21
• 1.5 趨化因子21-23
• 1.5.1 趨化因子簡介21-22
• 1.5.2 趨化因子表達與純化的研究進展22-23
• 1.5.3 趨化因子及其受體抑制劑的研究進展23
• 1.6 選題依據(jù)和研究內(nèi)容23-25
• 1.6.1 選題依據(jù)23-24
• 1.6.2 研究內(nèi)容24-25
• 2 白眉蝮蛇降纖酶的同源模建及B細胞抗原表位預(yù)測25-36
• 2.1 引言25-26
• 2.2 材料與方法26-27
• 2.2.1 降纖酶氨基酸序列選擇26
• 2.2.2 白眉蝮蛇降纖酶的線性抗原表位預(yù)測26-27
• 2.2.3 序列比對和基因樹27
• 2.2.4 白眉蝮蛇降纖酶的同源模建27
• 2.2.5 白眉蝮蛇降纖酶的構(gòu)象型抗原表位預(yù)測27
• 2.3 結(jié)果與分析27-35
• 2.3.1 白眉蝮蛇降纖酶的氨基酸序列27-28
• 2.3.2 白眉蝮蛇降纖酶的二級結(jié)構(gòu)及B細胞線性抗原表位的預(yù)測結(jié)果28-31
• 2.3.3 白眉蝮蛇降纖酶的同源模建結(jié)果31-33
• 2.3.4 白眉蝮蛇降纖酶的B細胞構(gòu)象型抗原表位33-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 3 黃曲霉果膠甲基酯酶的同源模建及其抑制機理分析36-47
• 3.1 引言36-37
• 3.2 材料與方法37-39
• 3.2.1 黃曲霉果膠甲基酯酶的序列確定37
• 3.2.2 多重序列比對37
• 3.2.3 模型的能量最小化優(yōu)化與評價37
• 3.2.4 分子對接37-39
• 3.3 結(jié)果與分析39-46
• 3.3.1 Blastp序列比對結(jié)果39-40
• 3.3.2 PROMAL 3D序列比對結(jié)果40-42
• 3.3.3 同源模建42
• 3.3.4 同源模建的評價42-44
• 3.3.5 抑制劑的分子對接結(jié)果44-46
• 3.4 小結(jié)46-47
• 4 人來源趨化因子CCL 1的重組制備、同源模建及抑制機理分析47-57
• 4.1 引言47
• 4.2 材料與方法47-50
• 4.2.1 實驗材料47-48
• 4.2.2 pET-28a(+)-CCL1表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)48-49
• 4.2.3 重組人來源趨化因子CCL1的表達49
• 4.2.4 重組人來源趨化因子CCL1的分離純化49
• 4.2.5 Western blotting49-50
• 4.2.6 重組人來源趨化因子CCL1的復(fù)性50
• 4.2.7 酶活力檢測和抑制劑的篩選50
• 4.2.8 同源模建與分子對接50
• 4.3 結(jié)果與分析50-56
• 4.3.1 陽性克隆的篩選50-51
• 4.3.2 CCL1在大腸桿菌細胞中的表達51-52
• 4.3.3 人來源的趨化因子CCL1的分離純化52
• 4.3.4 人來源趨化因子CCL1的同源模建52-53
• 4.3.5 人來源趨化因子CCL1抑制劑的篩選及抑制機理分析53-56
• 4.4 小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-65
• 附錄A 常用儀器一覽表65-66
• 附錄B 大腸桿菌轉(zhuǎn)化66-67
• 附錄C Western Blotting67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況68-69
• 致謝69-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：1128423