發(fā)布時間：2017-10-28 05:00

  本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒調(diào)控細胞應激顆粒機制的初步探討

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【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是黃病毒科黃病毒屬成員,為單正鏈RNA病毒。病毒基因組編碼單一開放閱讀框,其蛋白多肽前體經(jīng)切割形成結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白。且非結(jié)構(gòu)蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成復制復合體,為HCV復制提供場所。HCV極易形成持續(xù)性感染,是威脅人類健康的重要病原體。 已有文獻報道HCV感染細胞后,可使細胞產(chǎn)生應激顆粒。應激顆粒(Stress Granule, SG)是細胞在接受包括氧化物,病毒感染等一定程度的外界刺激后而產(chǎn)生的致密顆粒狀聚合體,由真核翻譯起始復合物,RNA結(jié)合蛋白以及停止翻譯的mRNA等成分組裝成,是細胞應激狀態(tài)下重要的調(diào)節(jié)元件。到目前為止,HCV誘生細胞應激顆粒的機制未明,且應激顆粒對HCV持續(xù)性感染是否存在影響未知,本研究擬探討HCV對細胞應激顆粒是否存在調(diào)節(jié)作用,并應激顆粒的產(chǎn)生對HCV形成持續(xù)性感染是否發(fā)揮作用。 本研究首先對HCV感染誘生的應激顆粒的組成及性質(zhì)進行了研究。利用免疫熒光染色,明確了HCV (JC1)感染Huh7細胞后所形成的應急顆粒包含四種應激顆粒關(guān)鍵成分,即翻譯相關(guān)蛋白eIF4G,eIF3A以及RNA結(jié)合蛋白G3BP1,TIA-1,故為完整的應激顆粒。同時發(fā)現(xiàn),HCV感染Huh7細胞誘生的應激顆粒能夠被氧應激型應激顆粒抑制劑放線菌酮(CHX)有效抑制,確認HCV誘生的應激顆粒典型應激顆粒。 在確認HCV能夠誘生典型應激顆粒的基礎上,發(fā)現(xiàn)HCV感染Huh7細胞后8小時應激顆粒陽性細胞的比例為3%：12小時內(nèi),應激顆粒陽性細胞比例上升至8%,在24小時達到峰值13.4%,48小時后回落至10%,72小時又升至13%左右,則表明HCV感染誘生的低水平應激顆粒,并存在波動。同時觀察到,相較于包括SFV、MHV等病毒在內(nèi)的多種RNA病毒在感染早期能夠使35%以上的被感染細胞產(chǎn)生應激顆粒,HCV在早期感染建立(即0-12小時內(nèi))時期僅誘生少量應激顆粒(約8%)。進而研究發(fā)現(xiàn)在應激顆粒誘導劑(亞砷酸鈉,NaAsO2)的刺激下,Huh7細胞感染HCVcc病毒8小時與不感染相比,誘生應激顆粒陽性細胞比例顯著下調(diào)了42%,提示HCV在感染早期具備抑制細胞誘生應激顆粒的能力。 以往研究表明病毒蛋白或核酸具備抑制應激顆粒形成能力,推測HCV早期感染翻譯出的病毒蛋白有可能通過某種機制抑制應激顆粒形成。于是進一步探討HCV五種主要病毒蛋白(core、NS3/4A、NS4B, NS5A、NS5B等)對細胞應激顆粒誘生水平的影響,發(fā)現(xiàn)在過表達的情況下,僅HCV RNA多聚酶NS5B能夠抑制亞砷酸鈉誘導產(chǎn)生的應激顆粒(降低約40%),并呈劑量依賴關(guān)系。同時還發(fā)現(xiàn),在表達NS5B并未能誘生應激顆粒的細胞中,應激顆粒組成分子G3BP1與NS5B呈部分共定位。同時NS5B的抑制功能及與G3BP1的共定位在HepaG2源的tet-on-NS5B誘導表達細胞系統(tǒng)中得以驗證(降低約42%)。進一步實驗證實,NS5B過表達不影響亞砷酸鈉誘導PKR激活以及e IF2α磷酸化的水平,表明NS5B抑制應激顆粒的形成發(fā)生在e IF2α磷酸化的下游,即應激顆粒裝配期,提示NS5B的抑制作用靶點為應激顆粒組成成分。綜上所述,NS5B抑制應激顆粒可能發(fā)生在裝配期,并與G3BP1共定位,同時本室前期曾報道G3BP1與NS5B存在相互作,提示NS5B可能通過直接與G3BP1相互作用以抑制應激顆粒。 為進一步確證NS5B是如何通過與G3BP1相互作用干擾應激顆粒形成,首先明確NS5B負責結(jié)合G3BP1的作用區(qū)段。構(gòu)建了G3BP1-GST融合蛋白以及NS5B三段主要截短突變體,利用GST pull-down實驗確認了NS5B中間手掌結(jié)構(gòu)段(96-454aa)負責與G3BP相互作用；進而在Huh7細胞過表達NS5B全長及其三段截短體,并用誘導劑誘生應激顆粒,發(fā)現(xiàn)僅過表達G3BP1的結(jié)合區(qū)段(NS5B,96-454aa)與NS5B全長能夠抑制應激顆粒的產(chǎn)生(NS5B,96-454aa下降35%；NS5B全長下降38%)。上述實驗結(jié)果表明,NS5B通過其中間手掌結(jié)構(gòu)段(96-454aa)與G3BP1相互作用而干擾應激顆粒的形成。 研究表明在持續(xù)刺激下,應激顆粒中的細胞mRNA會進入降解途徑使細胞受損,同時有報道發(fā)現(xiàn)HCV誘生的應激顆粒中大量包含有ISG基因mRNA而導致ISG蛋白表達水平下降,推測NS5B影響G3BP1抑制應激顆粒的生理學意義可能存在兩種解釋：一方面防止過量誘生應激顆粒造成細胞必需蛋白供應不足而受損以致影響感染建立,另一方面則通過上調(diào)干擾素刺激基因(ISG)的表達以幫助病毒維持低水平復制從而導致慢性化。實驗結(jié)果顯示NS5B不影響應激顆粒對管家基因β-actin的翻譯抑制。進一步通過過表達NS5B,干擾素及刺激劑處理等條件模擬HCV感染后病毒蛋白表達,誘生干擾素刺激基因(ISG)蛋白表達與應激顆粒的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS5B全長及手掌結(jié)構(gòu)段分別顯著上調(diào)應激顆粒對ISG分子ISG20, APOBEC3G翻譯抑制(全長：ISG20,上調(diào)141%；APOBEC3G,上調(diào)172%.手掌結(jié)構(gòu)段：ISG20,上調(diào)112%；APOBEC3G,上調(diào)134%)。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HCV RNA多聚酶NS5B通過其手掌結(jié)構(gòu)(96-454aa)與應激顆粒關(guān)鍵組成蛋白G3BP1相互作用,干擾G3BP1參與細胞應激顆粒的裝配,從而抑制HCV感染早期的12小時內(nèi)細胞應激顆粒的形成。這一結(jié)果提示HCV可能通過NS5B抑制應激顆粒,回復某些干擾素刺激基因編碼蛋白的表達,以負反饋途徑維持HCV低水平感染,這對于HCV持續(xù)性感染提供了一種可能的解釋,為進一步深入研究闡HCV與宿主細胞間關(guān)系提供了一定提示。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎 非結(jié)構(gòu)蛋白5B Ras GTP酶活化蛋白結(jié)合蛋白1(G3BP1) 應激顆粒 抑制形成
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 目錄3-4
• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-33
• 結(jié)果33-59
• 討論59-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-68
• 綜述68-79
• 參考文獻74-79
• 附錄79-80
• 一.在學期間學術(shù)交流情況79
• 二.論文發(fā)表情況79
• 三.獲獎情況79
• 四.教學工作情況79-80
• 致謝80-81

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