本文關(guān)鍵詞：突變型低氧誘導(dǎo)因子1α修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血性疾病的保護(hù)作用

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【摘要】：目的1、突變型低氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia inducible factor 1,HIF1α)對腦缺血區(qū)血管新生、血液供應(yīng)的恢復(fù)起到了積極而重要的作用。然而,在正常氧條件下,在低氧誘導(dǎo)因子1α的基因編碼序列區(qū)(Coding s e q u e n c e,CDS)中,第564位點脯氨酸在脯氨酸羥化酶的作用下,很短時間內(nèi)即被降解,第803位點天冬酰胺的轉(zhuǎn)錄活性被限制,從而抑制了HIF1α在正常氧條件下發(fā)揮其功能。因此,我們將HIF1α編碼序列區(qū)中第564位點脯氨酸及第803位點天冬酰胺的密碼子進(jìn)行定點基因突變,分別構(gòu)建在正常氧條件下及缺氧條件下能夠穩(wěn)定表達(dá)的突變型HIF1α重組腺病毒載體、在缺氧條件下能夠穩(wěn)定表達(dá)的野生型HIF1α重組腺病毒載體、及不含HIF1α基因的重組空腺病毒載體。2、取SD大鼠進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)培養(yǎng),傳代至第三代細(xì)胞待用。將成功構(gòu)建的突變型低氧誘導(dǎo)因子1α重組腺病毒載體、野生型重組腺病毒載體及重組空腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染大鼠第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,按最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)MOI=150進(jìn)行轉(zhuǎn)染。觀察低氧誘導(dǎo)因子1α在BMSCs中m RNA及蛋白的表達(dá)情況是否有差異,能否闡明基因突變對HIF1α基因及蛋白表達(dá)產(chǎn)生的影響。將轉(zhuǎn)染了三組重組腺病毒載體的BMSCs注射入經(jīng)過腦缺血再灌注模型(Middle cerebral artery occlusion model,MCAO)的大鼠體內(nèi),通過免疫組織化學(xué)染色等結(jié)果判定突變型HIF1α能否為腦缺血性疾病的治療帶來新希望。方法在這項研究中,我們使用定向位點突變方法,將第564位點脯氨酸及第803位點天冬酰胺兩個位點進(jìn)行突變,獲得HIF1α突變體,運(yùn)用p Ad Easy-1腺病毒試劑盒構(gòu)建突變型HIF1α腺病毒載體。將其用HEK293A細(xì)胞進(jìn)行包裝,大量擴(kuò)增腺病毒,純化后獲得高滴度腺病毒,并將其按MOI=150轉(zhuǎn)染至BMSCs中。RT-PCR及Western Blot檢測在正常氧環(huán)境下HIF1α基因在大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中m RNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。為了檢測突變型HIF1α重組腺病毒載體對腦缺血的治療作用,我們將三種不同的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染至BMSCs中,通過鼠尾靜脈將轉(zhuǎn)染后的BMSCs注射入經(jīng)MCAO造模的大鼠體內(nèi)。在MCAO造模后4周內(nèi),通過行為功能學(xué)測試(Modified neurological severity score,m NSS)及TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色,衡量大鼠的行為學(xué)損傷程度及腦梗死體積的大小。MCAO造模后第28天,采用Wertern Blot實驗方法檢測大鼠腦組織中血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達(dá)情況。通過免疫組織化學(xué)染色方法評估腦梗死區(qū)的微血管密度及血管新生情況。結(jié)果1、定點突變第564位脯氨酸和第803位天冬酰胺的HIF1α重組腺病毒載體、野生型HIF1α重組腺病毒載體及空腺病毒載體構(gòu)建成功。2、突變型HIF1α重組腺病毒載體、野生型HIF1α重組腺病毒載體、空腺病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSCs可見綠色熒光表達(dá)。3、RT-PCR結(jié)果表明:BMSCs組與空腺病毒組中細(xì)胞內(nèi)HIF1α的m RNA表達(dá)量之間無統(tǒng)計學(xué)意義;HIF1α組與突變HIF1α組細(xì)胞內(nèi)HIF1αm RNA表達(dá)量之間無明顯差異;HIF1α組、突變HIF1α兩組細(xì)胞內(nèi)HIF1αm RNA表達(dá)量明顯高于BMSCs組、空腺病毒兩組,存在顯著性差異(P0.05);Western blot檢測結(jié)果表明:突變HIF1α組細(xì)胞的HIF1α蛋白表達(dá)量明顯高于其他三組,存在顯著性差異(P0.05);而其他三組之間HIF1α蛋白表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。4、行為學(xué)評分結(jié)果顯示:從MCAO第7天開始,突變型HIF1α重組腺病毒載體組評分逐漸下降,而其他三組評分沒有顯著性差異;檢測腦梗死體積結(jié)果顯示:造模后第14天和第28天,突變型HIF1α重組腺病毒載體組腦梗死體積明顯低于其他三組,而其他三組之間無顯著性差異;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在MCAO造模后的第7天開始,血管生成數(shù)量明顯高于其他三組,而其他三組之間無顯著性差異。結(jié)論成功構(gòu)建能夠在常氧條件下高效穩(wěn)定表達(dá)的腺病載體,為腦缺血性疾病促血管新生治療開辟了新途徑。
【關(guān)鍵詞】：突變型低氧誘導(dǎo)因子1α 腦缺血性疾病 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 血管新生
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743
【目錄】：

• 中文論著摘要4-7
• 英文論著摘要7-9
• 英文縮略語9-11
• 前言11-12
• 實驗材料與方法12-24
• 結(jié)果24-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 本研究創(chuàng)新性的自我評價36-37
• 參考文獻(xiàn)37-48
• 附錄48-65
• 一、文獻(xiàn)綜述48-62
• 參考文獻(xiàn)51-62
• 二、在學(xué)期間科研成績62-63
• 三、致謝63-64
• 四、個人簡介64-65

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