發(fā)布時間：2017-05-01 16:09

  本文關鍵詞：基于干細胞的新型靶向復合生物基因載體的構建與其對缺血性腦卒中的治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：以靶向藥物轉運體系(TDDS)的理念,將特異性針對腦部病變組織的靶向肽通過適當的修飾使其有效連接到骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)表面,介導干細胞的主動靶向,同時采用非病毒載體高效安全地導入治療基因,構建全新的能趨向腦部疾病、攜載基因而自身又具有神經生長治療作用的復合功能生物載體,并結合安全性評價等,全面評估MSCs作為腦靶向生物載體的可行性及其針對缺血性腦卒中的治療前景。方法：1、合成N端修飾棕櫚酸的腦靶向肽段CLEVSRKNC,以棕櫚酸為錨點修飾到細胞膜表面,并篩選出最佳的修飾條件；2、利用流式細胞技術及熒光顯微成像技術對靶向肽修飾的干細胞(Pep-MSCs)進行表征,MTT法考察靶向肽細胞毒性,進一步考察靶向肽修飾對MSCs神經分化潛能的影響,明確靶向肽的修飾效率和生物安全性；3、建立體外神經元細胞和星形膠質細胞的氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,考察Pep-MSCs的體外遷移,同時考察Pep-MSCs對受損神經細胞的保護作用；4、建立大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,利用小動物活體成像技術和組織切片技術,考察Pep-MSCs對于腦部缺血病灶的靶向作用,以及Pep-MSCs在MCAO模型大鼠體內的分布；5、利用已經建立的非病毒載體轉染體系,采用自主合成的非病毒基因載體精胺-普魯蘭糖(spermine-pullulan, SP)對MSCs進行轉染,考察轉染效率；6、結合miR-133b的轉染和靶向肽修飾,在MCAO大鼠尾靜脈移植攜載miR-133b的Pep-MSCs (Pep-133b-MSCs)后,通過神經功能評分(mNSS)和組織切片觀察,評價niR-pep-MSCs的治療效果。結果：成功構建復合功能細胞基因載體Pep-MSCs,流式細胞技術測定靶向肽有較高的修飾效率,激光共聚焦顯微鏡觀察表明靶向肽成功地修飾到了細胞膜表面,MTT檢測和MSCs神經分化功能評價均表明此修飾方法安全有效。在體外OGD模型中,與未經修飾的MSCs相比,Pep-MSCs顯示出更高的遷移活性,同時靶向肽的修飾并未影響MSCs對于受損神經細胞的保護作用。將構建的Pep-MSCs尾靜脈移植到MCAO大鼠體內后,小動物活體成像以及組織切片結果顯示,靶向肽能介導MSCs到達缺血病灶,增強MSCs的歸巢性,同時減少MSCs在非病灶組織的分布。另一方面,利用已經建立的非病毒轉染體系對MSCs進行基因改造,非病毒載體SP能高效安全地轉染miR-133b,并且轉染miR-133b后的MSCs對受損神經細胞顯示更好的保護作用。進一步地,結合基因轉染和靶向肽修飾,攜載miR-133b的Pep-MSCs在尾靜脈移植到MCAO大鼠體內后顯示了較好的治療效果,mNSS評分顯示miR-pep-MSCs有更好的神經保護的作用,組織切片結果表明基因轉染和靶向肽修飾都未影響MSCs的神經分化功能。結論：成功構建Pep-MSCs,其對缺血性腦卒中病灶組織有很強的靶向性,作為復合功能基因靶向載體,其能攜載治療基因miR-133b到達病灶組織,又能發(fā)揮MSCs自身的治療作用,在缺血性腦卒中的治療中顯示了很好的應用潛力。
【關鍵詞】：骨髓間充質干細胞 靶向肽 腦靶向 缺血性腦卒中 干細胞療法 非病毒轉染
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 全文縮寫表13-19
• 引言19-24
• 第一章 靶向肽-骨髓間充質干細胞的構建24-37
• 1.1 儀器與試劑25-26
• 1.1.1 儀器25
• 1.1.2 試劑25-26
• 1.1.3 實驗動物26
• 1.2 實驗方法26-29
• 1.2.1 原代MSCs的制備和培養(yǎng)26-27
• 1.2.2 棕櫚酸(Palmitic acid,PA)-多肽-MSCs的修飾27
• 1.2.3 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)檢測27-28
• 1.2.4 大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的建立28
• 1.2.5 腦提取液的制備28-29
• 1.2.6 MSCs神經分化29
• 1.2.7 數據分析29
• 1.3 實驗結果與討論29-35
• 1.3.1 PA-peptide修飾條件的篩選29-32
• 1.3.2 PA-peptide修飾MSCs的表征32-33
• 1.3.3 PA-peptide修飾對MSCs生物活性的影響33-35
• 1.4 本章小結35-37
• 第二章 靶向肽修飾骨髓間充質干細胞的靶向性考察37-53
• 2.1 儀器與試劑37-39
• 2.1.1 儀器37-38
• 2.1.2 試劑38
• 2.1.3 實驗動物38-39
• 2.2 實驗方法39-41
• 2.2.1 原代培養(yǎng)星形膠質細胞(Astrocyte)39
• 2.2.2 Pep-MSCs體外遷移能力的考察39-40
• 2.2.3 MCAO模型的建立及鑒定40
• 2.2.4 Pep-MSCs的體內靶向性考察40-41
• 2.2.5 數據分析41
• 2.3 實驗結果與討論41-52
• 2.3.1 Pep-MSCs的體外趨向性考察41-46
• 2.3.2 Pep-MSCs的體內靶向性考察46-52
• 2.4 本章小結52-53
• 第三章 攜載治療基因的復合功能腦靶向載體對缺血性腦卒中治療效果的評價53-69
• 3.1 儀器與試劑53-55
• 3.1.1 儀器53-54
• 3.1.2 試劑54
• 3.1.3 實驗動物54-55
• 3.2 實驗方法55-58
• 3.2.1 SP/RNA復合物的制備55
• 3.2.2 轉染效率的評價和細胞毒性測試55
• 3.2.3 攜載miR-133b的MSCs對于受損星形膠質細胞的保護作用55-56
• 3.2.4 干細胞移植和行為學測試56-57
• 3.2.5 組織學分析57
• 3.2.6 MSCs體內神經分化能力評價57
• 3.2.7 數據分析57-58
• 3.3 結果與討論58-67
• 3.3.1 miR-133b的轉染58-62
• 3.3.2 轉染miR-133b的MSCs對受損星形膠質細胞的保護作用62-63
• 3.3.3 缺血性腦卒中的體內藥效學評價63-67
• 3.4 本章小結67-69
• 全文總結69-72
• 參考文獻72-81
• 綜述81-137
• References116-137
• 作者簡歷137-139

【參考文獻】

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1 張貴斌;邱張;徐運蘭;王偉;謝敏杰;;選擇性CDK抑制劑對大鼠局灶性腦缺血后膠質增殖及疤痕形成的抑制作用[J];神經損傷與功能重建;2006年03期

  本文關鍵詞：基于干細胞的新型靶向復合生物基因載體的構建與其對缺血性腦卒中的治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：339231