發(fā)布時(shí)間：2017-05-01 15:10

  本文關(guān)鍵詞：異甘草素對(duì)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化的影響及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究探討了不同濃度異甘草素對(duì)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化的影響及機(jī)制,旨在為異甘草素在治療人腦膠質(zhì)瘤的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)采用無血清培養(yǎng)基(含EGF、FGF、B27)以培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及Cyagen6孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板為載體培養(yǎng)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,通過CD133、Nestin聯(lián)合Bcl-2標(biāo)記進(jìn)行免疫熒光鑒定,并對(duì)比其倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)及干細(xì)胞球的形態(tài)、大小及數(shù)目,通過掃描電鏡觀察干細(xì)胞形態(tài)。(2)經(jīng)對(duì)比研究后,采用Cyagen 6孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板為載體提取、純化和培養(yǎng)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含EGF、FGF、B27)(含與實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO)為對(duì)照組,異甘草素(5~160μmol/L)為實(shí)驗(yàn)組,通過CCK-8法檢測(cè)作用12 h、24 h、48 h及72 h后的細(xì)胞活性,并觀察藥物作用至第7 d膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球的形成情況。(3)通過濃度和時(shí)間篩選后,以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含EGF、FGF、B27)(含與實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO)為對(duì)照組,異甘草素(10~160μmol/L)為誘導(dǎo)組,DAPT(2.0μmol/L)為阻斷劑組,異甘草素+阻斷劑組(10~160μmol/L+2.0μmol/L DAPT),通過免疫熒光染色觀察異甘草素作用24~72 h后細(xì)胞表面分化標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)及干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)表達(dá)情況,通過Western blot檢測(cè)異甘草素作用72 h后Nestin、GFAP及β-TubulinⅢ的表達(dá)情況,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)異甘草素作用72 h后的細(xì)胞周期,通過Real-time PCR檢測(cè)作用72 h后Notch1、RBP-JK及Hes1的表達(dá)。結(jié)果:(1)SHG44膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮克隆球樣生長(zhǎng),免疫熒光染色鑒定干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、Nestin表達(dá)呈陽性,且癌基因Bcl-2表達(dá)呈陽性;Cyagen 6孔懸浮培養(yǎng)板培養(yǎng)純化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球較培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶純化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球大且數(shù)目多(P0.05);對(duì)于Cyagen 6孔懸浮培養(yǎng)板,隨著純化次數(shù)增加,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球更大、數(shù)目更多(P0.05),且呈更規(guī)則球形;倒置顯微鏡下膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈類圓形,掃描電鏡下呈球形,可見較長(zhǎng)梭形突起和較多細(xì)小突起,細(xì)胞間以觸角溝通。(2)異甘草素在12-48h,隨著濃度增加細(xì)胞增殖活性增強(qiáng),且p0.05,72h后隨著濃度增加細(xì)胞增殖活性顯著降低,且p0.05;隔日加藥至第7d時(shí),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球數(shù)目減少、直徑減小(與對(duì)照組比),且p0.05,當(dāng)異甘草素濃度小于40μmol/l時(shí),與160μmol/l相比,干細(xì)胞數(shù)目、直徑均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),當(dāng)異甘草素濃度大于40μmol/l時(shí),與160μmol/l相比,干細(xì)胞數(shù)目、直徑均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)對(duì)照組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞無明顯分化,異甘草素組在24~48h,隨濃度增加分化細(xì)胞越多,且干細(xì)胞隨之減少,在72h后,隨著濃度增加分化細(xì)胞及干細(xì)胞同時(shí)減少。westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:異甘草素作用72h后:與對(duì)照組比較,隨著異甘草素濃度的增加nestin蛋白表達(dá)量逐漸下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與對(duì)照組比較,10、40、160μmol/l組gfap蛋白表達(dá)水平均上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且40μmol/l組gfap蛋白表達(dá)量較其他濃度組均較高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與對(duì)照組比較,10、40、160μmol/l組β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)水平均上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且10μmol/l組β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)量較其他濃度組均較高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果:異甘草素作用72h后,與對(duì)照組相比,隨著異甘草素濃度的增加g0/g1期細(xì)胞比例顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。real-timepcr檢測(cè)結(jié)果:notch1通路阻斷劑作用后,與對(duì)照組比較,各異甘草素組和阻斷劑組notch1、rbp-jk及hes1基因表達(dá)均顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與異甘草素組比較,notch1、rbp-jk及hes1基因表達(dá)在異甘草素加dapt組及阻斷劑組顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與阻斷劑組比較,notch1、rbp-jk及hes1基因表達(dá)在異甘草素加dapt組顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:(1)cyagen6孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板是培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較理想的載體。(2)異甘草素能誘導(dǎo)shg44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞分化,且能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖。(3)異甘草素誘導(dǎo)SHG44膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向星形細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分化可能與下調(diào)Notch1信號(hào)通路中的Notch1、RBP-JK及Hes1有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：異甘草素 SHG44膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 Notch1信號(hào)通路 分化作用 抑制作用
【學(xué)位授予單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 中英文縮略詞表12-13
• 前言13-15
• 實(shí)驗(yàn)研究15
• 實(shí)驗(yàn)一 不同無血清培養(yǎng)基載體提取SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的比較研究15-24
• 1 材料與方法15-16
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料15
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器15
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 2 試驗(yàn)方法16-17
• 2.1 無血清DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基配制16
• 2.2 人腦膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)16
• 2.3 采用不同無血清載體懸浮培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤SHG44干細(xì)胞16-17
• 2.4 免疫熒光染色鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球17
• 2.5 掃描電鏡觀察膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形態(tài)17
• 2.6 統(tǒng)計(jì)分析17
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-21
• 3.1 人腦膠質(zhì)瘤SHG44干細(xì)胞在不同無血清載體中的懸浮培養(yǎng)17-19
• 3.2 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)記物鑒定19-21
• 3.3 掃描電鏡下膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的形態(tài)21
• 4 討論21-24
• 實(shí)驗(yàn)二 應(yīng)用體外培養(yǎng)SHG44膠質(zhì)瘤干細(xì)胞篩選異甘草素抑制其增殖的最佳參數(shù)24-32
• 1 材料與方法24-25
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料24
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器24
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑24-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-26
• 2.1 SHG44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)25
• 2.2 SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)分組26
• 2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性26
• 2.5 異甘草素作用下SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形態(tài)觀察26
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-30
• 3.1 SHG44膠質(zhì)瘤干細(xì)胞鏡下形態(tài)26-27
• 3.2 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定27-28
• 3.3 不同濃度ISL對(duì)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞抑制的影響28-30
• 4 討論30-32
• 實(shí)驗(yàn)三 異甘草素對(duì)SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化的影響及作用分子機(jī)制32-43
• 1 材料與方法32-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料32
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器32
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-37
• 2.1 SHG44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)33
• 2.2 SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)33-34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)分組34
• 2.4 免疫熒光染色標(biāo)記分化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞34
• 2.5 異甘草素作用下SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形態(tài)觀察34-35
• 2.6 Western bliot方法步驟35-36
• 2.7 Real-time PCR方法步驟36-37
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 3.1 ISL誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化情況37-40
• 3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果40
• 3.3 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果40-41
• 4 討論41-43
• 結(jié)語43-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 文獻(xiàn)綜述一 異甘草素抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展48-54
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 文獻(xiàn)綜述二 Notch1通路介導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞耐藥的研究進(jìn)展54-61
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 致謝61-62
• 攻讀碩士研究生期間主要成果62

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1 汪云,曹玉華;毛細(xì)管電泳法測(cè)定甘草中的甘草素和異甘草素[J];分析測(cè)試學(xué)報(bào);2004年04期

2 張晶;楊靜;吳基良;詹春;張琳;;異甘草素脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性考察[J];中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志;2005年11期

3 慕春海;韓博;李超鵬;陳文;;多壁碳納米管對(duì)異甘草素和甘草素的選擇性吸附[J];石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年04期

4 黃繼偉;凌新龍;林海濤;;異甘草素的簡(jiǎn)便合成研究[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2012年10期

5 牛r�，胡享g�，竾�

本文編號(hào)：339149