背景腦膠質(zhì)瘤是腦部具有高度侵襲性的惡性腫瘤,該原發(fā)性腦腫瘤會嚴重破壞神經(jīng)系統(tǒng),預后極差。目前,腦膠質(zhì)瘤以綜合治療為主,其中膠質(zhì)母細胞瘤單純手術(shù)治療并不能給患者帶來生存獲益,而多項臨床研究已證實放療有助于延長該惡性腫瘤的生存期,如生存期會延長6~8個月。盡管放療在包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腦腫瘤治療中具有重要意義,但大多數(shù)接受放療者會于原發(fā)灶附近復發(fā),嚴重影響生存質(zhì)量。因此腦膠質(zhì)瘤的研究熱點多集中在探討提高腦膠質(zhì)瘤治療效果的細胞分子機制。癌癥的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因多個環(huán)節(jié),其中抑癌基因表觀遺傳沉默導致的功能抑制在該過程發(fā)揮重要作用,如細胞增殖、凋亡、信號轉(zhuǎn)導及DNA修復凋亡過程。表觀遺傳沉默是腦膠質(zhì)瘤研究的有力切入點。DNA甲基化在表觀遺傳沉默中較為常見,多種酶參與了甲基化的調(diào)節(jié)過程,其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)是負責建立和維護DNA甲基化的關(guān)鍵酶。UHRF1(ubiquitin-like wih PHD and ring finger domains1,泛素樣含PHD和環(huán)指域1)是目前DNA甲基化過程研究較多的蛋白,在多種惡性腫瘤中表達失調(diào),該因子可與半甲基化的DNA結(jié)合,被證實在甲基化維持中發(fā)揮重要作用,如UHRF1可誘導DNMT和蛋白脫乙�；刚心贾罝NA。新近研究表明UHFR1是一個重要的致癌基因,可在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中來調(diào)節(jié)基因表達和染色質(zhì)修飾。盡管UHRF1在DNA甲基化所必須的因子,但目前其在腦膠質(zhì)瘤中的表達模式尚不清楚,具體的作用方式也罕見報道。故本研究首先采用實時定量PCR(QPCR)檢測膠質(zhì)母細胞瘤組織中的UHRF1 mRNA水平,進一步分析該基因表達與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系,同時在腦膠質(zhì)瘤U251細胞中通過外源基因干擾手段來沉默UHRF1表達,來評價該蛋白對U251細胞增殖凋亡的影響,為揭示腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制及靶向治療靶點提供理論依據(jù)。目的1.確定腦膠質(zhì)瘤組織中UHRF1表達是否異常和具體表達模式。2.分析UHRF1水平與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系,進一步確定UHRF1是否參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。3.在體外沉默UHRF1表達對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響。方法收集本院2014年1月至2016年12月經(jīng)手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織44例及37例正常腦組織,采用實時熒光定量PCR(QPCR)檢測以上組織中的UHRF1 mRNA水平,分析腦膠質(zhì)瘤組織UHRF1 mRNA水平與腦膠質(zhì)瘤主要臨床病理學參數(shù)(年齡、性別、病理類型、分化程度、病理分級、瘤周水腫和浸潤深度)的關(guān)系;采用受試者工作特征曲線(ROC)分析組織UHRF1 mRNA從正常腦組織區(qū)分腦膠質(zhì)瘤的效能及腦膠質(zhì)瘤不同臨床病理參數(shù)的效能。采用脂質(zhì)Attractene reagent法將靶向沉默UHRF1表達的短發(fā)夾RNA(shRNA)載體LV-UHRF1-shRNA及陰性對照載體LV-scramble-shRNA分別轉(zhuǎn)染至U251細胞(LV-UHRF1-shRNA組和LV-scramble-shRNA組),以僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的細胞為對照組;采用實時熒光定量PCR(QPCR)檢測各組轉(zhuǎn)染48 h后的UHRF1 mRNA水平,采用MTT法檢測各組轉(zhuǎn)染24、48、72 h的增殖情況,BrdU染色法檢測轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h后的BrdU陽性率,Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48、72 h后的凋亡率,Western blotting檢測轉(zhuǎn)染72 h后的凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Caspase-3和Bcl-2)水平。結(jié)果1.QPCR檢測37例正常腦組織和44例腦膠質(zhì)瘤組織中的UHRF1 mRNA水平發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織的UHRF1 mRNA水平為2.668± 1.856,高于正常腦組織的1.217±0.741,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。UHRF1mRNA水平從正常腦組織中區(qū)分腦膠質(zhì)瘤組織的曲線下面積(AUC)為0.735[95%CI:0.628~0.843,P0.001],以2.895為截斷值時約登指數(shù)最高為0.386,靈敏度為38.64%,特異度為100.00%。2.UHRF1 mRNA水平與年齡、性別、病理類型及瘤周水腫無關(guān)(P0.05),與分化程度、病理分級和浸潤深度有關(guān)(P0.05),其中低分化的UHRF1 mRNA水平為3.526± 1.736,高于高、中分化的2.075±1.726,病理分期Ⅲ、Ⅳ期的UHRF1 mRNA 水平為 3.182± 1.759,高于 Ⅰ、Ⅱ 期的 1.993± 1.803,浸潤深度1/2 的 UHRF1mRNA 水平 3.562±1.903,高于≤ 1/2 的 2.106±1.618,以上差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.以腦膠質(zhì)瘤組織UHRF1 mRNA水平的均值(2.668)為界值將44例患者分為低表達組25例和高表達組19例。本研究分析UHRF1 mRNA水平分布與年齡、性別、病理類型、分化程度、病理分級、瘤周水腫和浸潤深度的關(guān)系,結(jié)果顯示UHRF1 mRNA水平分布與年齡、性別、病理類型及瘤周水腫無關(guān)(P0.05),與分化程度、病理分級和浸潤深度有關(guān)(P0.05),其中低分化的UHRF1高表達率為66.67%(12/18),高于高、中分化的26.92%(7/26),病理分期Ⅲ、Ⅳ期的UHRF1高表達率為56.00%(14/25),高于Ⅰ、Ⅱ期的26.32%(5/19),浸潤深度1/2 的 UHRF1 高表達率為 64.71%(11/17),高于≤ 1/2 的 29.63%(8/27),以上差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.QPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后各組的UHRF1 mRNA水平發(fā)現(xiàn),LV-UHRF1-shRNA組的UHRF1 mRNA水平為0.309±0.073,對照組的UHRF1 mRNA水平為1.098±0.136,LV-scramble-shRNA 組的 UHRF1 mRNA 水平為 1.127 ± 0.193,LV-UHRF1-shRNA 組的 UHRF1 mRNA 水平均低于對照組和 LV-scramble-shRNA 組(P0.05),對照組和LV-scramble-shRNA組UHRF1 mRNA水平的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后三組U251細胞的增殖水平,結(jié)果顯示與對照組和LV-scramble-shRNA組相比,LV-UHRF1-shRNA組在以上時間點細胞增殖率降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);對照組和LV-scramble-shRNA組以上時間點增殖率的差異無有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.采用BrdU染色法檢測轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h后三組U251細胞的BrdU陽性率,結(jié)果顯示與對照組和LV-scramble-shRNA組相比,LV-UHRF1-shRNA組在以上時間點細胞BrdU陽性率降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);對照組和LV-scramble-shRNA組以上時間點BrdU陽性率的差異無有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染72 h后三組U251細胞的凋亡率,結(jié)果顯示對照組、LV-scramble-shRNA組和LV-UHRF1-shRNA組的凋亡率分別為(7.73±0.66)%、(7.86±0.59)%和(25.71±1.87)%,LV-UHRF1-shRNA組的凋亡率高于對照組和LV-scramble-shRNA組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);對照組和LV-scramble-shRNA組凋亡率的差異無有統(tǒng)計學意義(P0.05)。8.采用Western blotting檢測染72 h后三組U251細胞的凋亡相關(guān)蛋白的表達情況,結(jié)果顯示與對照組和LV-scramble-shRNA組相比,LV-UHRF1-shRNA組的Bax、Caspase-3水平升高,而Bcl-2水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);對照組和LV-scramble-shRNA組凋亡相關(guān)蛋白水平的差異無有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.腦膠質(zhì)瘤組織中UHRF1水平異常升高,且對腦膠質(zhì)瘤的診斷有較好的效能。2.UHRF1表達升高參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。3.沉默UHRF1表達可抑制腦膠質(zhì)瘤的增殖并誘導凋亡。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

病理分期ＩＩＩ、ＩＶ期的ＵＨＲＦｌｍＲＮＡ水平為３．１８２±１．７５９，高于Ｉ、ＩＩ期的??１．９９３±丨．８０３，浸潤深度＞１／２?的?ＵＨＲＦ１?ｍＲＮＡ?水平?３．５６２±１．９０３，高于￡１／２?的??２．１０６土?１．６１８，以上差異均有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜０．０５）。見表２、圖２。??Ａ?８１?Ｂ?８－Ｊ?０?８－，??￥？．?．．．?％，－?■■■?％，．?■??１－?？?／?％－?？？?：?１－?＼?■??［?Ｈ?ＬＬ?？？?■：??Ｘ?２－?■■■■?Ｉ?Ｊ－?＊？？？？？?Ｉ?２＇?？？？＊?■■■■■??〇?”？?〇Ｊ?＊?〇?？秦???Ｓ５０歲?＞５０歲?女?男?Ｒ達Ｅ）編鼴琀?星形齩換編鼴癟??Ｄ?８＊｜?Ｅ?８－｜?Ｆ?８－??？?■■?％，．?．．．?．．．??＜?？參魯?■■■?＜?？？?？?＜?參參參?■■??ｉ?．?？?ｃ?．?？?■■■?ａ?４．?？？?■??Ｅ?４＇?＿?Ｅ?＊■?■?Ｅ?４．?？??〇Ｊ＿?，??〇Ｊ＿?；??〇Ｊ?＾＾—??￡．中?ｆｔ?ｉ、ｎ?ｍ、ｉｖ?ｆｔ度?中？鑫度??Ｇ?８－??５?６－?？

的ＵＨＲＦ１高表達率為５６．００％?（１４／２５），高于Ｉ、ＩＩ期的２６．３２％?（５／１９），浸潤??深度＞１／２?的?ＵＨＲＦ１?高表達率為?６４．７１％?（１１／１７），高于￡１／２?的?２９．６３％?（８／２７），??以上差異均有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜〇．〇５）。見表３、圖３。??Ａ?８１?Ｂ?＊－｜?Ｃ?？－｜??Ｂ－???＜＊－??５?丁?￣１￣￣?ｉ?丁?￣１￣?ｉ?￣１￣?，丁??Ｃ??１??ｕ；?Ｃ??？２－?????｜?２－?????｜?２－?????Ｄ?■?—?Ｊ?Ｉ?Ｌ?Ｉ?］?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?Ｄ??????Ｊ?—Ｌ－?＼?Ｊ?—＿ｊ＿?Ｊ?＿Ｌ?—Ｌ－??〇?Ｓ５０歲?＞５０歲?女?宄?Ｒｆｉ母編ｆｔ＊?１形？達編跑＊??Ｄ?Ｅ?＊１?Ｆ?＊■??Ｍ－?Ｗ－??＊?６．?—Ｔ—?—ｒ－?＊?Ｓ－?—Ｔ—?＊?？■?—ｆ－??ｌ?丨丁?ｌ?Ｔ?￣１￣?＾?￣１￣｜?丁????１?心??塋?２－????Ｉ?空?２－?Ｌ?Ｊ?塋?２－??????＼?ｔ＝＾ｉ?ＪＴ?＼?Ｌｚｒ＾?ｔ＾ｄ??＾?寘．中?ｆｔ?°?ｉ?．?ｎ?ｍ、ｉｖ?°?ｆｉ度?中、鑫癀??Ｇ?？？??ｗ－??＊６．?——?￣｜￣??ｂ－??＜１ｆ２?＞１ｆ２??Ａ：年

０．５７７￣０．８９２，?Ｐ＝０．００８］和?０．７３６［９５％ＣＩ：?０．５８１?？０．８９２，?Ｐ＝０．００９］，約登指數(shù)為?０．４３６、??０．５２４?和?０．４３１，敏感度為?６６．６７％、８４．００％和?７６．４７％，特異度為?７６．９２％、６８．４２％??和６６．６７％。見表４、圖４。??ａ?，００１?－―＾?ｂ?，０〇ｉ?ｃ?，Ｍｉ?ｐｚｒ－??《ｙ?ｉ?ｔ?＊°?｜—??１?？．?１?？■?Ｊ／?１?？■?，＿Ｉ??５?—ｒ－１?／?５?ｒ－ｉ—＾?Ｓ?Ｊ??２０－?２０－??０－Ｕ—￣Ｉ?．?．?．?１?〇４＾???１?．?．?ｏ－ｌ￣?，?，?，???０?２０?４０?６０?８０?１００?０?２０?４０?６０?８０?１００?０?２０?４０?ＳＯ?８０?１００??１００％?－?Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ＾
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本文編號：2872619