CO中毒是當今發(fā)生率和死亡率最高的中毒,尤其在我國北方地區(qū)意外生活性中毒中致死人數(shù)最多。在空氣中濃度超過30mg/m3時能引起中毒。常見來源是工業(yè)中煉鋼、煉焦以及以CO作為原料的化學工業(yè)、汽車排出的廢氣和火車通過隧道、礦井爆炸以及消防隊救火、冬季火爐取暖門窗密閉等。內(nèi)蒙古自治區(qū)地處北方高原地區(qū),農(nóng)牧區(qū)人口較多,供暖期較長,CO中毒及遲發(fā)性腦病更為常見。CO中毒后可以造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害為主的多臟器病變,其中急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(Delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)是最常見且嚴重的并發(fā)癥,發(fā)病率約為13~50%,死亡率可達31%。本病從急性期中毒癥狀改善到腦病發(fā)作(癥狀出現(xiàn))之間有一段類似痊愈的時間,稱假愈期。由于假愈期有一段類似痊愈的時間,往往易被患者及家屬誤認為治愈,因此,患者常常錯過最佳治療時間。DEACMP患者多數(shù)起病較急,臨床癥狀較重,以癡呆癥狀為主,臨床表現(xiàn)多樣為特點。且具有較高的致殘率和致死率,嚴重影響患者生存質(zhì)量。一旦患者發(fā)生DEACMP,目前尚無有效的治療手段和策略,給患者帶來終生痛苦,給家庭和社會帶來巨大負擔,臨床上迫切需要闡明DEACMP的發(fā)病機制,為臨床早期干預和降低DEACMP事件的發(fā)生具有重要的臨床意義。目前DEACMP發(fā)病機制尚未完全闡明。單純?nèi)毖鯇W說不能完全解釋其發(fā)病機制。眾多文獻研究顯示腦組織損傷涉及早期損傷和二次損傷,損傷后腦內(nèi)膠質(zhì)細胞在數(shù)量和形態(tài)上發(fā)生了一系列變化,急性CO中毒及DEACMP的過程與腦損傷和二次損傷非常相似。而近年來的研究進展顯示,從DEACMP存在“假愈期”的發(fā)病特點和病程早期的病理損傷表現(xiàn)來看,免疫學損傷機制更有可能合理解釋這一疾病特點。而小膠質(zhì)細胞是公認的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫效應細胞。目前,從這一角度研究CO中毒致病機理的報道甚少,如從這一方面進行突破研究,可能會有助于闡明DEACMP的發(fā)病過程,從而進一步解釋DEACMP的發(fā)病機制,為臨床檢測、治療和預防提供依據(jù)。既往研究發(fā)現(xiàn)CO中毒后靜息態(tài)的小膠質(zhì)細胞形態(tài)發(fā)生改變,與巨噬細胞形態(tài)相似,發(fā)生明顯聚集,提示小膠質(zhì)細胞變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。而我們前期研究發(fā)現(xiàn),CO中毒后釋放的炎癥細胞因子攻擊髓鞘堿性蛋白,使髓鞘堿性蛋白脫失繼而引發(fā)脫髓鞘改變。而給予地塞米松治療后,炎癥細胞因子的釋放及髓鞘堿性蛋白的脫失均明顯受到抑制。但CO中毒后活化的小膠質(zhì)細胞是否通過釋放大量的炎性細胞因子繼而引發(fā)慢性炎癥反應,引起髓鞘堿性蛋白的脫失,最終介導DEACMP的發(fā)生,并且CO通過何種途徑介導小膠質(zhì)細胞活化值得我們進一步研究。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)及其水解產(chǎn)物二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)是維持機體細胞正常代謝所必須的能量載體,但同時也是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。P2嘌呤受體是ATP等嘌呤類物質(zhì)的生理性受體,包括7種離子型通道P2X受體和13種G蛋白耦聯(lián)P2Y受體。其中P2Y12受體是P2Y受體家族中的重要一員,廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),陽性細胞以小膠質(zhì)細胞為主。有研究報道多種傷害性刺激均可引起ATP釋放,ATP和水解產(chǎn)物ADP均可活化小膠質(zhì)細胞。而Haynes學者在大腦皮質(zhì)損傷小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)在損傷組織釋放的ATP刺激下,P2Y12受體激活從而使小膠質(zhì)細胞活化,并在P2Y12受體基因敲除模型中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化,提示P2Y12受體的激活在小膠質(zhì)細胞活化過程中具有重要作用�；谀壳案鞣N研究學說在解釋DEACMP的發(fā)病機制均存在一定局限性。結(jié)合已往學者的文獻報道和我們的前期研究結(jié)果。因此本研究通過建立DEACMP大鼠模型并給予P2Y12受體抑制劑,應用水迷宮實驗評價認知功能,應用高效液相色譜法、流式細胞儀檢測法測定大鼠海馬組織內(nèi)ATP含量及小膠質(zhì)細胞活化情況,進一步闡明DEACMP的發(fā)病機制,為該病防治提供新的思路和依據(jù)。第一部分一氧化碳中毒所致遲發(fā)性腦病大鼠模型的建立目的建立急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(DEACMP)大鼠模型,為探索其潛在機制提供實驗對象。方法經(jīng)Morris水迷宮訓練合格的204只Wistar大鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組按照不同的中毒濃度再次隨機分為1000ppm組、3000ppm組及4000ppm組。實驗組分別通入濃度為1000ppm、3000ppm、4000ppm的一氧化碳(CO)氣體40分鐘(min)建立中毒大鼠模型。對照組通入空氣。采用分光光度計法監(jiān)測碳氧血紅蛋白(COHb)含量,行Morris水迷宮實驗評價認知功能,行HE染色觀察海馬組織細胞損傷情況。結(jié)果1.CO中毒后大鼠出現(xiàn)典型中毒表現(xiàn)。2.COHb含量與吸入CO濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.748,P0.05)。3.對照組及各實驗組大鼠死亡率分別為0%、0%、40.74%、58.97%。4.Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示:對照組和1000ppm組大鼠的逃避潛伏期中毒前后無變化,二組比較無差異。3000ppm組:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠的逃避潛伏期無變化,與對照組及1000ppm組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第21d、28d,大鼠的逃避潛伏期延長,與對照組及1000ppm組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4000ppm組:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠的逃避潛伏期無變化,與對照組及1000ppm組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第21d、28d,大鼠的逃避潛伏期延長,與對照組及1000ppm組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05),與3000ppm組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.HE染色結(jié)果顯示:對照組及1000ppm組大鼠海馬細胞排列有序,細胞結(jié)構(gòu)完整;3000ppm組及4000ppm組大鼠在中毒后第21d、28d可見海馬細胞數(shù)減少、細胞層變薄、細胞結(jié)構(gòu)紊亂、細胞皺縮明顯、結(jié)構(gòu)不清,但未見明顯壞死灶。結(jié)論靜態(tài)吸入濃度為3000ppm的CO氣體40分鐘,21天后可以成功建立DEACMP大鼠模型。為本研究提供穩(wěn)定、可靠的動物模型。第二部分小膠質(zhì)細胞活化與DEACMP的相關(guān)性研究目的研究小膠質(zhì)細胞活化與急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(DEACMP)的相關(guān)性。方法經(jīng)Morris水迷宮訓練合格的236只Wistar大鼠隨機分為一氧化碳(CO)中毒組、DEACMP組和對照組。CO中毒組按照靜態(tài)吸入濃度為1000ppm的CO氣體40分鐘建立CO中毒大鼠模型;DEACMP組按照靜態(tài)吸入濃度為3000ppm的CO氣體40分鐘建立DEACMP大鼠模型。對照組通入空氣。行Morris水迷宮實驗評估認知功能,行HE染色觀察海馬組織細胞損傷情況,采用流式細胞儀分析小膠質(zhì)細胞活化水平。結(jié)果1.CO中毒后大鼠出現(xiàn)典型中毒表現(xiàn)。2.Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示:對照組和CO中毒組大鼠的逃避潛伏期中毒前后無變化(P0.05),二組比較無差異(P0.05)。DEACMP組:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠的逃避潛伏期無變化(P0.05),與對照組及CO中毒組比較均無統(tǒng)計學意義(P0.05),第21d、28d,大鼠的逃避潛伏期延長,與對照組及CO中毒組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.HE染色結(jié)果顯示:對照組及CO中毒組大鼠海馬細胞排列有序,細胞結(jié)構(gòu)完整;DEACMP組大鼠在中毒后第21d、28d可見海馬細胞數(shù)減少、細胞層變薄、細胞結(jié)構(gòu)紊亂、細胞皺縮明顯、結(jié)構(gòu)不清。4.小膠質(zhì)細胞活化水平結(jié)果顯示:CO中毒組:CO中毒后第7d,小膠質(zhì)細胞活化水平正常,與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第14d增高,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),第21d、28d降低,與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。DEACMP組:CO中毒后第7d,小膠質(zhì)細胞活化水平正常,與對照組及CO中毒組比較均無統(tǒng)計學意義(P0.05),第14d、21d及28d明顯增高,與對照組及CO中毒組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.大鼠海馬組織小膠質(zhì)細胞活化與DEACMP的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。2.CO中毒濃度不同,小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)不同。隨著中毒濃度的升高,中毒時間的延長,小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)以經(jīng)典激活狀態(tài)(M1型)為主。第三部分P2Y12受體介導小膠質(zhì)細胞活化在DEACMP中的作用目的研究P2Y12受體介導小膠質(zhì)細胞活化在急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(DEACMP)中的作用。方法按照靜態(tài)吸入濃度為3000ppm的一氧化碳(CO)氣體40分鐘建立DEACMP大鼠模型。將192只造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為干預組及DEACMP組,每組96只,另設(shè)對照組。干預組給予腹腔注射蘇拉明;DEACMP組及對照組給予腹腔注射等劑量生理鹽水。應用Morris水迷宮實驗評價認知功能,行HE染色觀察海馬組織細胞損傷情況,采用高效液相色譜法、流式細胞檢測法分析大鼠海馬組織內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)含量變化及小膠質(zhì)細胞活化情況。結(jié)果1.CO中毒后大鼠出現(xiàn)典型中毒表現(xiàn)。2.Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示:對照組大鼠逃避潛伏期中毒前后比較無統(tǒng)計學差異(P0.05);DEACMP組:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠逃避潛伏期無變化,與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第21d、28d,大鼠逃避潛伏期延長,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05);干預組:CO中毒前及中毒后第7d、14d,大鼠逃避潛伏期無變化,與對照組及DEACMP組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第21d、28d,大鼠逃避潛伏期延長,介于對照組和DEACMP組之間,與兩組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.HE染色結(jié)果顯示:對照組大鼠海馬細胞排列有序,細胞結(jié)構(gòu)完整;DEACMP組大鼠在中毒后第21d、28d可見海馬細胞數(shù)減少、細胞層變薄、細胞結(jié)構(gòu)紊亂、細胞皺縮明顯、結(jié)構(gòu)不清;干預組病理學改變介于兩組之間。4.小膠質(zhì)細胞活化水平結(jié)果顯示:DEACMP組:CO中毒后第7d,小膠質(zhì)細胞活化水平未增高,與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第14d、21d及28d明顯增高,與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。干預組:CO中毒后第7d,小膠質(zhì)細胞活化水平未增高,與對照組及DEACMP組比較均無統(tǒng)計學意義(P0.05),第14d、21d及28d增高,但介于兩組之間,與兩組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.ATP含量結(jié)果顯示:DEACMP組:CO中毒后第7d,海馬組織內(nèi)ATP含量未增高,與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05),第14d、21d及28d明顯增高,與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。干預組:CO中毒后第7d,海馬組織內(nèi)ATP含量未增高,與對照組及DEACMP組比較均無統(tǒng)計學意義(P0.05),第14d、21d及28d明顯增高,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),但與DEACMP組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論ATP可通過P2Y12受體途徑介導小膠質(zhì)細胞活化,活化的小膠質(zhì)細胞其功能發(fā)生改變并分泌多種炎癥刺激因子進而參與了DEACMP的發(fā)生發(fā)展。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R595.1;R747.9
【部分圖文】：

圖 1 大鼠急性 CO 中毒表現(xiàn)Fig. 1 manifestations of acute CO poisoning in ratsA：中毒前大鼠無明顯異常變化；B：中毒 10min，大鼠出現(xiàn)煩躁、多動、不表現(xiàn)；C：中毒 30min，大鼠活動減少、四肢癱軟、呼吸急促、皮毛乍起、肢端口周皮膚呈櫻桃紅色，部分發(fā)生抽搐及昏迷；D：中毒 40min，將大鼠移出中毒，大鼠中毒濃度加深，部分死亡。.2 各組大鼠 COHb 含量各組大鼠中毒后 15min 血 COHb 含量均升高，1000ppm 組 COHb 含量波動于6.32～22.92%之間；3000ppm 組及 4000ppm 組 COHb 含量波動于 32.13～75.65%間。隨著中毒時間的延長，血 COHb 含量逐漸降低，4h 時中毒組大鼠血 COHb降至正常。COHb 含量與 CO 中毒濃度大小呈正相關(guān)(r=0.748，P<0.05)。結(jié)果見

圖 2 各中毒組大鼠血 COHb 含量變化ig. 2 changes of COHb content in blood of rats in each poisoning group鼠死亡率的比較及 1000ppm 組大鼠均無死亡；3000ppm 組大鼠死亡率為 4大鼠死亡率為 58.97%。實驗組大鼠死亡率兩兩比較均有統(tǒng)計結(jié)果見表 1。表 1 各組大鼠死亡率的比較Table 1 comparison of rat mortality in each group別 總鼠數(shù)(N)死亡鼠數(shù)(n) 死亡 32 0 pm 組 32 0 pm 組 54 22 40

Table 2 comparison of escape latency of morris water maze test in rats of each group：與對照組比較，*P<0.05，與 1000ppm 組比較，#P<0.05，與 3000ppm 組比較，※P<0.0.5 病理學檢查結(jié)果普通光鏡下見對照組大鼠腦海馬細胞正常，排列整齊。中毒后 21d、28d000ppm 組和 4000ppm 組大鼠可見海馬細胞數(shù)減少、細胞層變薄、細胞結(jié)構(gòu)紊亂胞皺縮明顯、結(jié)構(gòu)不清，但未見明顯壞死灶(圖 3)。組別 中毒前 7d 14d 21d 28d對照組1000ppm 組3000ppm 組4000ppm 組17.3±3.6 19.3±5.8 23.2±6.7 19.6±5.3 20.6±6.116.9±5.9 19.6±7.7 22.6±14.3 18.6±7.8 19.6±7.017.3±3.9 20.9±8.9 21.7±9.3 41.7±16.4*#42.2±19.816.4±6.4 28.7±13.1 28.6±10.9 50.0±18.6*#48.2±12.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張玲;潘杰;;高效液相色譜法測定小鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP的含量[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2008年21期

本文編號：2834470