目的GBM(glioblastoma,神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)是CNS(central nervous system,中樞神經(jīng)系統(tǒng))的高侵襲性和治療極具挑戰(zhàn)性的原發(fā)性腫瘤,目前可獲得的治療對(duì)這種疾病患者只有有限的效果。因此,開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)和有效的治療策略至關(guān)重要。ACNU(nimustine,鹽酸尼莫司汀)廣泛用作標(biāo)準(zhǔn)化療藥物,經(jīng)常與其他化療藥物以聯(lián)合用藥的形式進(jìn)行臨床研究。姜黃素是一種天然多酚類化合物,有與其他化療藥物聯(lián)合用于腫瘤治療的可能性。然而,沒(méi)有關(guān)于ACNU和姜黃素聯(lián)合用于GBM治療的研究報(bào)告,并且其活性的機(jī)制仍然知之甚少。在本研究中,我們探索了姜黃素和ACNU聯(lián)合治療對(duì)GBM細(xì)胞的影響與其機(jī)制。方法在本實(shí)驗(yàn)中,采用CCK8法測(cè)姜黃素和尼莫司汀不同處理人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U118和U87后的細(xì)胞活力;同時(shí)也姜黃素與尼莫司汀對(duì)人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞SVGp12細(xì)胞活力的影響。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn),侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)研究了姜黃素與尼莫司汀聯(lián)合用藥對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲與遷移活性的影響。利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了細(xì)胞周期測(cè)定和細(xì)胞凋亡檢測(cè),研究姜黃素與尼莫司汀聯(lián)合用藥對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的促細(xì)胞自噬作用與細(xì)胞周期抑制作用。在分子機(jī)制研究中,運(yùn)用激光共聚焦免疫熒光技術(shù),研究在姜黃素與尼莫司汀聯(lián)合作用于U87后,細(xì)胞線粒體內(nèi)外細(xì)胞色素c,及p50與p65的變化;采用Western blot研究了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl和Bax,細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、CDK1和CDK2,細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白N-cadhetin、MMP2和MMP9,PI3K/AKT通路蛋白和NF-κB/COX-2通路相關(guān)蛋白水平,在姜黃素和尼莫司汀聯(lián)合作用于神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系后的變化;利用Real-time quantitative PCR(q PCR),研究姜黃素與尼莫司汀聯(lián)合作用于神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U118和U87,對(duì)COX-2 m RNA水平的影響。結(jié)果與姜黃素或ACNU單獨(dú)用藥相比較,聯(lián)合用藥能夠通過(guò)抑制N-cadherin和MMP2/9蛋白表達(dá),抑制人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞遷移與侵襲活性。同時(shí)聯(lián)合用藥還能強(qiáng)化藥物對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。其主要機(jī)制通過(guò)3條途徑完成:第一條是通過(guò)抑制p65/p50二聚體的激活與核內(nèi)轉(zhuǎn)移抑制NF-Κb,從而抑制COX-2表達(dá);第二條是通過(guò)抑制p-PI3K和AKT信號(hào)通路的激活;第三條是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);在通過(guò)以上三條途徑共同抑制細(xì)胞增殖。此外下調(diào)Cyclin B1、CDK1、CDK2誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。通過(guò)以上機(jī)制共同作用達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過(guò)同時(shí)靶向調(diào)節(jié)N-cadherin/MMP2/9,cyto c/caspase,PI3K/AKT和NF-κB/COX-2信號(hào)通路加強(qiáng)ACNU對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)母膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖和侵襲抑制作用,同時(shí)還增加其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的作用。姜黃素和ACNU的聯(lián)合治療將有可能成為神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療方案的新選擇。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

大連醫(yī)科大學(xué)大學(xué)碩士學(xué)位論文強(qiáng)了 ACNU 所導(dǎo)致的 U118MG，U87MG 和 U251MG 細(xì)胞活力的抑制。相反的是，該治療模型在正常人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系 SVG p12 中在相同濃度下不管是單獨(dú)還是聯(lián)合用藥，均沒(méi)有顯示出明顯的細(xì)胞毒性，即使在相對(duì)較高的藥物濃度 SVGp12 依然保持較高的細(xì)胞活力。另外，我們計(jì)算了 ACNU 單獨(dú)或與姜黃素聯(lián)合用藥作用于三個(gè)細(xì)胞系 IC50 值。如圖 1B 所示，與用 ACNU 單獨(dú)處理的細(xì)胞系相比，用 ACNU 和姜黃素（20uM）聯(lián)合治療可導(dǎo)致 IC50 值的顯著降低，ACNU 單獨(dú)用藥的 IC50 比姜黃素與 ACNU 聯(lián)合用藥高出一倍以上，尤其是 U87MG 細(xì)胞對(duì)聯(lián)合治療比其他兩種細(xì)胞系顯現(xiàn)出更高的敏感性。

大連醫(yī)科大學(xué)大學(xué)碩士學(xué)位論文姜黃素聯(lián)合治療后誘導(dǎo)的 G2 / M 期阻滯細(xì)胞百分比較前兩者均明顯升高。 為了明確這些觀察結(jié)果的詳細(xì)機(jī)制，我們對(duì)聯(lián)合用藥 48 h 后的 U118MG 和 U87MG 細(xì)胞采用了 western blot 技術(shù)觀察 G2 期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白因子（CDK1，CDK2 和 cyclin B1）的表達(dá)。結(jié)果可見(jiàn)（圖 2E），在分別給予姜黃素 20uM 和 ACNU 100uM 以及兩種藥物聯(lián)合處理的蛋白條帶中，兩種細(xì)胞系均發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組的蛋白條帶灰度更低。這些結(jié)果表明， ACNU 和姜黃素的聯(lián)合用藥可誘導(dǎo) CDK1，CDK2 和 cyclin B1 蛋白水平的顯著降低。 以上這些數(shù)據(jù)提供的證據(jù)表明，姜黃素確實(shí)可以通過(guò)誘導(dǎo) G2/M期細(xì)胞周期阻滯，至少部分地增強(qiáng) ACNU 介導(dǎo)的 GBM 細(xì)胞增殖抑制。

圖 3 姜黃素與 ACNU 聯(lián)合處理后的細(xì)胞遷移與侵襲結(jié)果Figure 3 Effects of combination treatment with curcumin and ACNU on cell migrationand invasion.Notes: (A) Migration of U118MG and U87MG cells was analyzed by scratch assay.After 48 h treatment with ACNU (100 μM) or curcumin (20 μM), alone or incombination, the wound gap was observed and photographed. (B) Percentages ofmigration cells were calculated relative to the original gap. (C) Cell invasion wasanalyzed in U87MG cells treated with ACNU (100 μM) or curcumin (20 μM), alone orin combination, for 24 h. Cell invasion was observed and photographed, and thepercentage of invasion cells (D) was calculated. (E) Levels of expression of N-cadherin,vimentin, and MMP-2/9 proteins were analyzed by Western blot in the differenttreatment groups. Densitometric measurements were normalized to β-actin, expressedrelative to the control group (set as 1), and are reported beneath Western blot images.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Andreas F.Hottinger;Roger Stupp;Krisztian Homicsko;;Standards of care and novel approaches in the management of glioblastoma multiforme[J];Chinese Journal of Cancer;2014年01期

本文編號(hào)：2828435