【摘要】：背景缺血性腦卒中是指由于腦的供血?jiǎng)用}(頸動(dòng)脈或椎動(dòng)脈系統(tǒng))狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱。我國(guó)是全世界卒中發(fā)病率最高的國(guó)家之一,現(xiàn)有腦卒中患者10×10~6例,其中約85%為缺血性腦卒中,這無(wú)疑給患者及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)和極大的痛苦。我國(guó)是人口大國(guó),缺血性腦卒中發(fā)病率逐年攀升、且復(fù)發(fā)率高于全球平均水平,嚴(yán)重影響了國(guó)民生存及生活質(zhì)量。缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、Ca~(2+)超載、氧化應(yīng)激損傷等多種機(jī)制。越來(lái)越多的研究顯示,炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用,炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、破壞血腦屏障的完整性以及加重腦組織水腫等,因此,減輕炎癥反應(yīng),防治炎性損傷已成為改善缺血性腦卒中預(yù)后的研究方向和治療策略。脂氧素(lipoxins,LXs)是機(jī)體在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì),具有強(qiáng)大抗炎、促炎癥消退的作用。近年來(lái)一些研究初步顯示LXA4對(duì)缺血性腦卒中有保護(hù)作用,但其作用的內(nèi)在機(jī)制和確切環(huán)節(jié)尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦卒中的炎癥反應(yīng)中起著重要作用,小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞,在缺血性腦卒中后可被迅速激活,激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞主要存在M1型和M2型兩種極化狀態(tài),分別發(fā)揮促炎及抗炎雙重作用。在缺血性腦卒中發(fā)病過(guò)程中LXA4是否能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化進(jìn)而達(dá)到抗炎和減輕炎癥損傷作用及其相關(guān)機(jī)制尚不清楚,至今未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬從動(dòng)物和細(xì)胞水平研究LXA4對(duì)腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,并初步探討其可能的機(jī)制,旨在為臨床治療缺血性腦卒中提供新的思路,為L(zhǎng)XA4治療缺血性腦卒中提供新的依據(jù)。目的1.觀察LXA4在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的抗炎及神經(jīng)功能保護(hù)的作用。2.闡明LXA4對(duì)腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響。3.探討LXA4對(duì)腦缺血再灌注損傷過(guò)程中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化調(diào)控的分子機(jī)制。方法1.體內(nèi)運(yùn)用改良的線栓法構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注損傷模型,模型建立后立即通過(guò)側(cè)腦室注射LXA4進(jìn)行干預(yù),缺血2小時(shí)后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注,在既定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2.體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,構(gòu)建氧糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen sugar deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型并給予LXA4預(yù)處理,氧糖剝奪處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞6小時(shí),復(fù)糖復(fù)氧12小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。3.通過(guò)Longa法進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、TTC染色觀察腦梗死及水腫體積的大小、HE染色觀察梗死的損傷程度及病理變化及TUNEL染色觀察梗塞灶周圍神經(jīng)元凋亡的情況。4.免疫熒光觀察激活后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。5.RT-PCR和ELISA分別檢測(cè)炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)情況。6.RT-PCR、Western-blot和免疫熒光分別檢測(cè)iNOS和CD32(M1型極化標(biāo)志物)、Arg-1和CD206(M2型極化標(biāo)志物)的mRNA和蛋白表達(dá)情況。7.RT-PCR和Western-blot檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)的Notch-1、Hes-1及Hes-5的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中,通過(guò)行為學(xué)評(píng)分、TTC染色、HE染色及TUNEL染色,明顯觀察到側(cè)腦室注射LXA4可顯著降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、梗死和水腫體積、神經(jīng)元壞死及凋亡。2.Iba1免疫熒光結(jié)果顯示,靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)小胞體,高度分枝狀,激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大,突起變短,呈球狀的“阿米巴狀”,LXA4干預(yù)后可輕度抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,但大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)仍呈“阿米巴狀”。3.體內(nèi)大鼠MCAO后24h和體外BV2小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R12h后,IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高(P0.05),LXA4進(jìn)行干預(yù)后,IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量均下降(P0.05)。4.體內(nèi)大鼠MCAO后第3天和體外BV2小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R12h后,M1型Marker(iNOS、CD32)和M1型Marker(Arg-1、CD206)的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高(P0.05);LXA4干預(yù)后,M1型Marker CD32的mRNA及蛋白表達(dá)量均下降(P0.05),M1型Marker iNOS的蛋白表達(dá)量下降(P0.05),mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化(P0.05),M2型Marker(Arg-1、CD206)的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高(P0.05);體外BV2小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R12h后iNOS和Arg-1、CD32與CD206的免疫熒光雙染結(jié)果與上述一致。5.體內(nèi)大鼠MCAO后第3天和體外BV2小膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R12h后Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白Notch-1、Hes-1和Hes-5的mRNA和蛋白表達(dá)量均升高(P0.05),LXA4干預(yù)后,Notch-1和Hes-1的mRNA和蛋白表達(dá)量下降(P0.05),Hes-5的mRNA和蛋白表達(dá)量升高(P0.05)。結(jié)論1.LXA4可降低大鼠腦缺血再灌注損傷后梗死體積并減輕其神經(jīng)功能損傷。2.LXA4可抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后及體外培養(yǎng)的氧剝奪復(fù)氧后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和炎癥因子的表達(dá)。3.LXA4可調(diào)控腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞及體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的極化,抑制其向M1型極化、促進(jìn)其向M2型極化。4.LXA4對(duì)腦缺血再灌注及氧剝奪后復(fù)氧的小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控可能是通過(guò)Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743
【圖文】：

用介導(dǎo)的[2, 10, 11]。Notch 受體表達(dá)于細(xì)胞膜表面，因此可被解聯(lián)蛋白和酶（ADAM）17 或-10 和早老素依賴性 γ-分泌酶復(fù)合物切割。切割后位至細(xì)胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子 CSL 相互作用，從而激活下游靶基因[12CSL 單獨(dú)存在時(shí)作為轉(zhuǎn)錄抑制劑來(lái)抑制靶基因的表達(dá)，但在與 NICD導(dǎo)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。

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