【摘要】：目的本課題擬通過(guò)建立蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)大鼠模型,檢測(cè)建模后1h、6h、12h、24h、48h、72h神經(jīng)功能損害評(píng)分、腦水腫程度、海馬神經(jīng)元凋亡水平以及腦組織內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)相關(guān)的表達(dá)因子CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、海馬葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和Caspase-12的表達(dá),并與空白對(duì)照組和假手術(shù)組對(duì)照比較,來(lái)探討ER stress與SAH后早期腦損傷(EBI)的相關(guān)性及作用機(jī)制。材料和方法1.選取成年雄性SD大鼠78只,體質(zhì)量(300±50)g,采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組6只、假手術(shù)組36只與SAH組36只。2.采用視交叉前池注血法建立SAH模型。大鼠穿刺點(diǎn)在冠狀縫前5mm、中線(xiàn)旁開(kāi)3 mm處。假手術(shù)組注入生理鹽水0.3ml,SAH組注入自體動(dòng)脈血0.3 ml。3.參照Kaoutzanis等的行為學(xué)評(píng)分進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分:觀察進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)反應(yīng)、睜眼反應(yīng)�？偡�11分,最低3分。對(duì)各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。4.組織固定及處理:斷頭法取腦,取下兩側(cè)海馬及額葉底部腦組織,用于檢測(cè)Caspase-12、CHOP、GRP78蛋白的表達(dá)、神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平,剩余腦組織用于干濕重測(cè)定評(píng)估腦水腫情況。5.TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞。6.Western blot法檢測(cè)CHOP、GRP78、Caspase-12蛋白的定量表達(dá)。7.干濕稱(chēng)重法計(jì)算腦組織標(biāo)本水含量來(lái)反映腦水腫程度:計(jì)算公式為:腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。8.電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),了解神經(jīng)元凋亡情況。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)全部采用二因素方差分析,并利用LSD法進(jìn)行多重比較。對(duì)于各個(gè)指標(biāo)兩兩之間計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù),并進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.建立SAH模型結(jié)果:SAH組建模中有1只大鼠因麻醉死亡,3只大鼠因注血后72h內(nèi)死亡,病死率11.11%;假手術(shù)組建模中有2只大鼠因麻醉死亡,1只大鼠注生理鹽水后72h內(nèi)死亡,病死率8.33%;空白對(duì)照組無(wú)死亡,病死率0;三組實(shí)驗(yàn)死亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),及時(shí)補(bǔ)充7只大鼠繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。解剖取腦標(biāo)本后空白對(duì)照組、假手術(shù)組無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血或僅有少許蛛網(wǎng)膜下腔出血;SAH組大鼠取腦后在Willis環(huán)周?chē)梢?jiàn)明顯蛛網(wǎng)膜下腔積血,部分標(biāo)本在視交叉池、環(huán)池、腳間池等腦池處可見(jiàn)較多血凝塊。2.神經(jīng)功能缺陷評(píng)分結(jié)果:(1)大鼠經(jīng)水合氯醛溶液腹腔麻醉后1h未完全清醒,無(wú)法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。一般3h后大鼠逐漸恢復(fù)清醒,故從6 h開(kāi)始評(píng)分。(2)空白對(duì)照組、假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分無(wú)明顯變化,接近滿(mǎn)分,兩組比較組內(nèi)、組間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組評(píng)分6h開(kāi)始下降,24h達(dá)到谷值,然后逐漸上升,第6h、12h、24h、48h、72hSAH組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較明顯降低,組間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(4)SAH組在24h時(shí)間點(diǎn)下降最為明顯,組內(nèi)與其他時(shí)間點(diǎn)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.腦水腫檢測(cè):(1)空白對(duì)照組及假手術(shù)組腦水腫程度輕微,組間、組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組6h腦水腫開(kāi)始加重,24h達(dá)到峰值,48、72h腦水腫仍較重。第12、24、48、72h SAH組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較腦水腫明顯,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組在24h時(shí)間點(diǎn)水腫最嚴(yán)重,與1h、6h、12h、72h比較組內(nèi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但與48h時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡結(jié)果:(1)空白對(duì)照組、假手術(shù)組海馬神經(jīng)元凋亡不明顯,組間、組內(nèi)比較差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組神經(jīng)元凋亡較明顯,12h凋亡細(xì)胞明顯增多,24h凋亡細(xì)胞達(dá)到峰值,48 h凋亡細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始逐漸下降,72h凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少,在6、12、24、48、72h SAH組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但在1h時(shí)間點(diǎn)SAH組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組組內(nèi)比較24h時(shí)間點(diǎn)凋亡最嚴(yán)重,與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.Western blot檢測(cè)CHOP蛋白表達(dá)結(jié)果:(1)空白對(duì)照組、假手術(shù)組CHOP蛋白表達(dá)微弱,組間、組內(nèi)在不同時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組CHOP蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較明顯增多,SAH組6h CHOP蛋白表達(dá)開(kāi)始上升,于24h達(dá)到峰值,然后逐漸下降,72h仍有較明顯表達(dá),第12、24、48、72hSAH組與對(duì)照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但第1h、6h SAH組與對(duì)照組、假手術(shù)組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組內(nèi)24h時(shí)間點(diǎn)CHOP蛋白表達(dá)最明顯,與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.Western blot檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)結(jié)果:(1)空白對(duì)照組、假手術(shù)組GRP78蛋白均表達(dá)微弱,組間、組內(nèi)在不同時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組GRP78蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組、假手術(shù)組明顯增高,SAH后6h開(kāi)始上升,于24 h達(dá)到峰值,然后逐漸下降,72 h表達(dá)仍較明顯,第12h、24h、48h、72h SAH組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但在第1h、6h SAH組與對(duì)照組、假手術(shù)組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組內(nèi)24h時(shí)間點(diǎn)GRP78蛋白表達(dá)最明顯,與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。7.Western blot檢測(cè)Caspase-12表達(dá)結(jié)果:(1)空白對(duì)照組、假手術(shù)組Caspase-12表達(dá)微弱,組間、組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)SAH組Caspase-12表達(dá)較空白對(duì)照組、假手術(shù)組明顯增高,SAH后6h開(kāi)始明顯上升,于24h達(dá)到峰值,然后逐漸下降,72h仍有少量表達(dá),第6h、12h、24h、48h、72h SAH組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),第1h SAH組與對(duì)照組、假手術(shù)組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)SAH組內(nèi)24h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)最明顯,與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。8.電鏡觀察結(jié)果:SAH組海馬神經(jīng)元凋亡比較嚴(yán)重,術(shù)后6h即可見(jiàn)細(xì)胞皺縮,體積變小,12h時(shí)胞質(zhì)內(nèi)空泡較多,細(xì)胞核體積變小,核膜下染色質(zhì)邊集、濃聚,呈現(xiàn)凋亡表現(xiàn),24h時(shí)最為嚴(yán)重,可見(jiàn)細(xì)胞核裂解,凋亡小體形成�？瞻讓�(duì)照組及假手術(shù)組海馬神經(jīng)元及細(xì)胞器形態(tài)良好。9.根據(jù)Spearman相關(guān)性分析顯示,SAH組大鼠的CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白表達(dá)結(jié)果與腦水腫嚴(yán)重程度及神經(jīng)元凋亡結(jié)果之間存在極顯著正相關(guān),與神經(jīng)功能缺陷評(píng)分存在極顯著負(fù)相關(guān)(P0.05)。其中在SAH后24h時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)最為明顯。結(jié)論本研究表明:(一)在SAH后72h內(nèi)CHOP、GRP78和Caspase-12表達(dá)均顯著增高,說(shuō)明SAH后確實(shí)發(fā)生了ER stress。(二)通過(guò)分析空白對(duì)照組、假手術(shù)組、SAH組的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、腦水腫程度和神經(jīng)元凋亡的差異,以及電鏡下細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài),說(shuō)明在SAH早期確實(shí)發(fā)生了EBI。(三)證實(shí)了CHOP、GRP78和Caspase-12表達(dá)與EBI嚴(yán)重程度之間均存在正相關(guān),初步揭示CHOP、GRP78和Caspase-12表達(dá)在SAH后EBI的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,其主要機(jī)制是SAH后過(guò)度激活的ER stress通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡(endoplasmic reticulum associated death,ERAD)途徑造成了的大腦皮層神經(jīng)元凋亡。(四)為今后深入研究SAH后EBI的發(fā)生機(jī)制及尋找針對(duì)性的治療策略、潛在治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R743.35
【圖文】：

圖I空白對(duì)照組大鼠腦組織標(biāo)本:蛛網(wǎng)膜下腔無(wú)出血

假手術(shù)組大鼠腦組織標(biāo)本:29h時(shí)問(wèn)點(diǎn)大鼠可有少

穿刺原因部分可見(jiàn)少許蛛網(wǎng)膜下腔出血，但無(wú)血凝塊（圖２）邋；邋ＳＡＨ組大鼠取腦后在Ｗｉｌｌ邋ｉｓ逡逑環(huán)周?chē)梢?jiàn)明顯蛛網(wǎng)膜下腔積血，部分標(biāo)本在視交叉池、環(huán)池、腳間池等腦池處可見(jiàn)較多逡逑血凝塊（圖３）。逡逑圖１空白對(duì)照組大鼠腦組織標(biāo)本：蛛網(wǎng)膜下腔無(wú)出血逡逑＿逡逑ｍｍ逡逑Ｍｍ逡逑圖２假手術(shù)組大鼠腦組織標(biāo)本：２４ｈ時(shí)間點(diǎn)大鼠可有少許蛛網(wǎng)膜下腔出血。逡逑灥＿逡逑ＨＡ逡逑圖３邋ＳＡＨ組大鼠腦組織標(biāo)本：ＳＡＨ組２４ｈ大鼠視交叉池環(huán)池等明顯蛛網(wǎng)膜下腔出血，部分形成血凝塊，逡逑嚴(yán)重者橋前池也可見(jiàn)明顯蛛網(wǎng)膜下腔出血。逡逑２．２神經(jīng)功能缺陷評(píng)分結(jié)果：逡逑（１）大鼠經(jīng)水合氯醛溶液腹腔麻醉后ｌｈ未完全清醒，無(wú)法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。一般逡逑３ｈ后大鼠逐漸恢復(fù)清醒，故從６邋ｈ開(kāi)始評(píng)分。逡逑

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10 徐翔;應(yīng)用亞低溫治療蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的遲發(fā)血管痙攣的動(dòng)物研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

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1 馬巖朋;蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水的診治進(jìn)展[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

2 張航;Neuritin對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡通路影響的研究[D];石河子大學(xué);2018年

3 孫笑菲;不同腦狹窄動(dòng)脈與自發(fā)性大腦凸面蛛網(wǎng)膜下腔出血相關(guān)性研究[D];鄭州大學(xué);2018年

4 齊文濤;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的相關(guān)性研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

5 王琳;腦血管造影陰性的蛛網(wǎng)膜下腔出血患者臨床特征及預(yù)后分析[D];蘇州大學(xué);2018年

6 方遠(yuǎn)堅(jiān);早期預(yù)測(cè)自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦梗死的新型評(píng)分：mSWAI評(píng)分[D];浙江大學(xué);2018年

7 李勇;circRNAs及mRNAs在小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后大腦皮層中的差異表達(dá)譜研究[D];西南醫(yī)科大學(xué);2018年

8 金建祥;丹酚酸B鎂在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷中的作用及其機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

9 孫曉晗;自發(fā)性大腦凸面蛛網(wǎng)膜下腔出血的臨床影像特點(diǎn)、病因及預(yù)后分析[D];山東大學(xué);2018年

10 賈昊坤;動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血并發(fā)下肢深靜脈血栓的相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

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