【摘要】：背景(1)癲癇是一種常見的可致殘的腦部疾病,由多種原因?qū)е轮袠猩窠?jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元高度同步化異常放電所致,以反復(fù)發(fā)作的癇性發(fā)作為特點。目前全球癲癇患者數(shù)量達(dá)5000萬之多,其中約20-30%患者發(fā)展為耐藥性癲癇,需要終生藥物治療,且對藥物療效反應(yīng)不佳,這給患者的身心健康、工作生活等一系列方面帶來嚴(yán)重影響,因次,癲癇已成為全社會關(guān)注的公共衛(wèi)生問題,迫切需要對其發(fā)作、發(fā)生、發(fā)展機制以及在此基礎(chǔ)上挖掘出的干預(yù)靶點進(jìn)行研究。(2)癲癇發(fā)作過程伴有組織酸化,酸敏感離子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是一種配體門控離子通道,當(dāng)細(xì)胞外氫離子濃度升高時激活開放,所以該通道在癲癇發(fā)作中扮演了一定角色。但目前對酸敏感離子通道在癲癇發(fā)作中的作用尚不明確,有諸多爭議,特別是關(guān)于該通道是促癲癇發(fā)作還是抗癲癇發(fā)作,多方證據(jù)各執(zhí)一詞。酸敏感離子通道3(acid sensing ion channel 3,ASIC3)是該通道的亞基之一,它對酸性刺激最為敏感,開放過程中表現(xiàn)為雙相電流,亞基失活速度慢,保持開放時間長,因此最有可能對癲癇發(fā)作進(jìn)行調(diào)控。目前,該亞基在癲癇發(fā)作方面的研究較少,值得深入挖掘。目的(1)本研究旨在探討癲癇發(fā)作動物模型和癲癇發(fā)作細(xì)胞模型中ASIC3的表達(dá)變化。(2)通過研究ASIC3對癲癇發(fā)作動物行為學(xué)的影響及相關(guān)的分子機制,為抗癲癇發(fā)作藥物研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。方法(1)ASIC3在癲癇發(fā)作動物中的表達(dá):采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作大鼠模型,用蛋白印跡檢測不同時間點動物海馬區(qū)ASIC3的蛋白表達(dá)變化;用RT-PCR技術(shù)檢測不同時間點動物海馬區(qū)ASIC3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化;用免疫組織化學(xué)檢測動物海馬區(qū)ASIC3的免疫染色強度。(2)ASIC3在癲癇發(fā)作細(xì)胞模型中的表達(dá):培養(yǎng)新生大鼠海馬原代神經(jīng)元,采用免疫熒光染色鑒定純度;用無鎂外液誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇樣放電,并用膜片鉗技術(shù)予以證實;用蛋白印跡檢測神經(jīng)元癲癇樣放電后ASIC3的表達(dá)變化。(3)ASIC3對癲癇發(fā)作動物行為學(xué)的影響:采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作大鼠模型,用ASIC3特異性阻斷劑APETx2進(jìn)行側(cè)腦室注射,采用Racine評分評價動物癲癇發(fā)作潛伏期、最大發(fā)作強度、全身強直陣攣發(fā)作(Generalized tonic-clonic seizures,GTCS)比例以及發(fā)作強度隨時間的變化曲線。(4)ASIC3對癲癇發(fā)作影響的機制研究:在癲癇發(fā)作大鼠模型中,采用蛋白印跡檢測ASIC3 抑制后對 NMDA 受體(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs)、AMPA受體(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors,AMPARs)各亞基表達(dá)的影響;用免疫共沉淀檢測ASIC3和NMDA受體、AMPA受體的相互作用;用蛋白印跡檢測NMDA受體下游信號通路鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ,CaMKⅡ)和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的變化情況;用膜片鉗檢測在無鎂外液誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作細(xì)胞模型中ASIC3抑制后神經(jīng)元自發(fā)和誘發(fā)動作電位發(fā)放的變化,用膜片鉗檢測ASIC3抑制后海馬腦片中NMDA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynapticcurrent,mEPSC)和誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)的變化。結(jié)果(1)蛋白印跡檢測顯示,正常大鼠海馬組織有ASIC3的本底表達(dá),癲癇發(fā)作2小時后表達(dá)水平即開始增高,24小時顯著升高,48小時到達(dá)平臺期,72小時略有降低;RT-PCR顯示,正常大鼠海馬組織有ASIC3的mRNA本底表達(dá),隨著癲癇發(fā)作后時間推移,ASIC3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加;免疫組織化學(xué)顯示,正常大鼠海馬區(qū)ASIC3的免疫反應(yīng)強度較弱,癲癇發(fā)作24小時后,免疫反應(yīng)強度顯著升高。(2)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)過MAP-2免疫熒光染色鑒定純度較高;培養(yǎng)12-14天后,在電流鉗模式I = 0條件下進(jìn)行全細(xì)胞模式記錄顯示,正常組海馬神經(jīng)元可見偶發(fā)的自發(fā)動作電位發(fā)放,而無鎂外液誘導(dǎo)3小時組可見密集的動作電位發(fā)放;無鎂外液誘導(dǎo)組神經(jīng)元ASIC3蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高。(3)側(cè)腦室注射ASIC3的抑制劑APETx2后,大鼠癲癇發(fā)作潛伏期顯著縮短,癲癇發(fā)作最大強度顯著增加,全身強直陣攣發(fā)作發(fā)生率顯著增加,在匹羅卡品注射后15分鐘、30分鐘、60分鐘時間點癲癇發(fā)作強度顯著高于假手術(shù)組,45分鐘時間點癲癇發(fā)作強度無顯著差異。(4)側(cè)腦室注射ASIC3的抑制劑APETx2后,大鼠癲癇發(fā)作后NMDA受體NR1、NR2A、NR2B亞基膜蛋白表達(dá)升高,而AMPA受體亞基GluR1膜蛋白表達(dá)未見明顯改變;ASIC3和NR1、NR2A、NR2B亞基之間存在蛋白相互作用,但和AMPA受體的GluR1亞基沒有相互作用;APETx2預(yù)處理顯著增加了大鼠癲癇發(fā)作后磷酸化CaMKⅡα蛋白和磷酸化CREB蛋白表達(dá)水平;AP5抑制NMDA受體功能后反轉(zhuǎn)了APETx2預(yù)處理引發(fā)的癲癇發(fā)作程度加劇。無鎂外液誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元經(jīng)過APETx2處理后自發(fā)動作電位和誘發(fā)動作電位發(fā)放數(shù)均增加;經(jīng)過APETx2預(yù)處理的癲癇發(fā)作大鼠腦片中NMDA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)頻率和幅度增加,NMDA 受體介導(dǎo)的誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)也增加。結(jié)論(1)ASIC3在大鼠氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作模型和無鎂外液誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型中均表達(dá)升高。(2)抑制ASIC3加劇了氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作模型中大鼠癲癇發(fā)作嚴(yán)重度,增加了無鎂外液中原代海馬神經(jīng)元興奮性。(3)抑制ASIC3加劇動物癲癇發(fā)作嚴(yán)重度與NMDA受體上調(diào)、NMDA受體下游CaMKⅡ和CREB信號通路激活以及突觸傳遞中NMDA受體介導(dǎo)的mEPSC和eEPSC增加相關(guān)。(4)ASIC3是機體自身抗癲癇發(fā)作的內(nèi)源性保護(hù)機制,加強ASIC3的功能可能成為防治癲癇發(fā)作的新途徑。
【圖文】：

鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的本底表達(dá)，癲癇發(fā)作２小時后ＡＳＩＣ３表達(dá)水平即開始增高（Ｐ＜逡逑０．０５），隨著時間推移，表達(dá)逐漸升高，２４小時顯著升高（Ｐ＜邋０．０１），４８小時至ＩＪ達(dá)平臺逡逑期，７２小時略有降低（圖１．１）。逡逑ａ邐ｂ邋２－°＇邐“ａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ邐ｃ＿邋１５．邐＊邋＾邋Ｍ｜邋Ｂ：邋Ｈ｜逡逑ＡＳＩＣ３邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑＿ｎＩＨＷｉＭＭｉ４２ｋＤａ＾°－５－邋ｌｌｌｌｌ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑圖１．１蛋白印跡檢n,不同時間點大鼠海馬組織中ＡＳＩＣ３的蛋白表達(dá)情況（每組ｎ邋＝逡逑４，邋＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，和對照組相比）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｆｏｒ邋ＡＳＩＣ３邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｎｄ逡逑ｓｅｉｚｕｒｅ邋ｒａｔｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔｓ邋（＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ）逡逑２．２邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＡＳＩＣ３在vq癇發(fā)作動物模型海馬中的表達(dá)逡逑提取動物海馬組織總ＲＮＡ，逆轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后，以此為模板進(jìn)行ＡＳＩＣ３基因ＰＣＲ逡逑擴增，結(jié)果顯示，正常大鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的ｍＲＮＡ本底表達(dá)，癲癇發(fā)作后２小時逡逑至７２小時

鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的本底表達(dá)，癲癇發(fā)作２小時后ＡＳＩＣ３表達(dá)水平即開始增高（Ｐ＜逡逑０．０５），隨著時間推移，表達(dá)逐漸升高，２４小時顯著升高（Ｐ＜邋０．０１），４８小時至ＩＪ達(dá)平臺逡逑期，７２小時略有降低（圖１．１）。逡逑ａ邐ｂ邋２－°＇邐“ａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ邐ｃ＿邋１５．邐＊邋＾邋Ｍ｜邋Ｂ：邋Ｈ｜逡逑ＡＳＩＣ３邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑＿ｎＩＨＷｉＭＭｉ４２ｋＤａ＾°－５－邋ｌｌｌｌｌ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑圖１．１蛋白印跡檢n,不同時間點大鼠海馬組織中ＡＳＩＣ３的蛋白表達(dá)情況（每組ｎ邋＝逡逑４，，邋＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，和對照組相比）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｆｏｒ邋ＡＳＩＣ３邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｎｄ逡逑ｓｅｉｚｕｒｅ邋ｒａｔｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔｓ邋（＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ）逡逑２．２邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＡＳＩＣ３在vq癇發(fā)作動物模型海馬中的表達(dá)逡逑提取動物海馬組織總ＲＮＡ，逆轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后，以此為模板進(jìn)行ＡＳＩＣ３基因ＰＣＲ逡逑擴增，結(jié)果顯示，正常大鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的ｍＲＮＡ本底表達(dá)，癲癇發(fā)作后２小時逡逑至７２小時
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1

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