【摘要】：研究背景與目的:缺血性腦卒中(Ischemic Stroke,IS)是由于腦動脈管腔狹窄或阻塞,導(dǎo)致灌流區(qū)的腦組織缺血、缺氧或壞死為主要臨床表現(xiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我國是IS的高發(fā)國家,其具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特點(diǎn)。IS發(fā)生的一個重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的形成及發(fā)展,而炎癥在AS發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。5-脂氧合酶激活蛋白/5-脂氧合酶(5-lipoxygenase activating protein/5-lipoxygenase,FLAP/5-LO)通路是炎癥介質(zhì)白三烯(Leukotriene,LT)代謝的重要環(huán)節(jié),在白三烯生物合成早期起重要作用。5-脂氧合酶激活蛋白基因(5-lipoxygenase activating protein,ALOX5AP)編碼合成FLAP蛋白,FLAP和5-LO結(jié)合調(diào)節(jié)LT的生物合成,進(jìn)而激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,增加血管內(nèi)壁的黏附和通透性,參與AS的發(fā)展進(jìn)程,與IS的發(fā)生密切相關(guān)。Str?m等研究發(fā)現(xiàn)敲除ALOX5AP基因的小鼠,其體內(nèi)LT的生物合成受到顯著抑制,減緩了缺血性腦損傷的發(fā)生。許曉偉等在動物水平評價了ALOX5AP基因mRNA的表達(dá)水平與腦卒中的關(guān)系,結(jié)果表明ALOX5AP基因的過表達(dá)與高血壓性腦卒中存在相關(guān)性。本課題組前期應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對40例IS患者與40例對照者外周血中ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了初步檢測與分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IS病例組外周血中ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組。由此,我們推測IS患者外周血中ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平高于對照組,并可能通過參與動脈壁的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)IS的發(fā)生。表觀遺傳學(xué)的興起為揭示基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新思路,它是指在基因組DNA序列不發(fā)生改變的情況下,基因的表達(dá)發(fā)生了可遺傳的改變。DNA甲基化(DNA methylation)是表觀遺傳調(diào)控的重要形式之一,它是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的作用下,將甲基基團(tuán)添加在基因組DNA分子胞嘧啶上,形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)。通常認(rèn)為,DNA甲基化會阻礙轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合,從而抑制基因的表達(dá)。然而,ALOX5AP基因啟動子區(qū)甲基化對IS患者外周血ALOX5AP基因表達(dá)的影響尚不清楚。此外,位于CpG位點(diǎn)上的SNP稱為CpG-SNP,它可以增加或去除相應(yīng)的CpG位點(diǎn),導(dǎo)致等位基因特異性甲基化(allele-specific methylation,ASM)的現(xiàn)象,對基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。然而,ALOX5AP基因啟動子區(qū)CpG-SNPs能否通過ASM影響DNA甲基化進(jìn)而影響基因的表達(dá)有待進(jìn)一步探討。微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物細(xì)胞內(nèi)一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA,主要通過結(jié)合靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR),降解mRNA或者阻礙蛋白質(zhì)的翻譯過程,進(jìn)而下調(diào)靶基因的表達(dá)水平。然而IS患者外周血血漿中某些特定的miRNAs是否影響了IS患者外周血ALOX5AP基因的表達(dá)目前尚不清楚。綜上所述,本課題提出如下假說:ALOX5AP基因啟動子區(qū)的DNA甲基化及miRNA調(diào)控等表觀遺傳機(jī)制可能影響了IS患者外周血ALOX5AP基因的表達(dá),并通過參與動脈壁的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了IS的發(fā)生。本研究將揭示DNA甲基化及miRNA對IS患者外周血ALOX5AP基因表達(dá)的影響,為IS發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制及人群防治提供新的理論依據(jù)。研究對象:研究方案已經(jīng)通過鄭州大學(xué)、鄭州市第一人民醫(yī)院、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院及河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有受試者均為河南漢族人群,并且均簽署了知情同意書。1.檢測ALOX5AP基因mRNA表達(dá)的研究對象病例組為2016年4月至2017年7月在鄭州市第一人民醫(yī)院及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的IS患者150例,其中男性95例,女性55例,平均年齡60.76±12.83歲。所有患者的診斷均依據(jù)WHO所制定的IS診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)過了各項(xiàng)檢查(病史、體征、臨床生化檢驗(yàn)、CT或MRI)確診。對照組為同期性別、年齡與病例組相匹配且無心腦血管疾病的健康體檢個體150例,其中男性80例,女性70例,平均年齡60.83±13.44歲。2.檢測ALOX5AP基因啟動子區(qū)甲基化的研究對象研究對象同檢測ALOX5AP基因mRNA表達(dá)的研究對象。3.檢測血漿miRNA表達(dá)的研究對象病例組為2016年4月至2017年7月在鄭州市第一人民醫(yī)院及河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的IS患者50例,其中男性30例,女性20例,平均年齡62.42±13.04歲。所有患者的診斷均依據(jù)WHO所制定的IS診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)過了各項(xiàng)檢查(病史、體征、臨床生化檢驗(yàn)、CT或MRI)確診。對照組為同期性別、年齡與病例組相匹配且無心腦血管疾病的健康體檢個體50例,其中男性28例,女性22例,平均年齡58.80±13.66歲。研究方法:1.采用天根公司的高效血液總RNA提取試劑盒提取RNA,并對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對外周血中ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測與分析。2.采用天根公司的血液基因組提取試劑盒提取DNA,通過MethylTarget目的區(qū)域甲基化測序的方法對ALOX5AP基因啟動子區(qū)的Cp G位點(diǎn)進(jìn)行DNA甲基化水平的檢測與分析。3.應(yīng)用KASP基因分型技術(shù)對CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,并比較不同基因型個體間DNA甲基化水平及ALOX5AP基因mRNA表達(dá)水平之間的差異。4.雙熒光素酶報告基因的實(shí)驗(yàn)方法檢測不同等位基因轉(zhuǎn)錄活性的差異。5.采用天根公司的血漿miRNA提取分離試劑盒提取血漿miRNAs,并對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對外周血血漿中miR-335及miR-495的表達(dá)水平進(jìn)行檢測與分析。6.雙熒光素酶報告基因的實(shí)驗(yàn)方法探討miR-335、miR-495結(jié)合ALOX5AP基因的3’UTR區(qū)。7.本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。所有定量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表示,兩組之間的定量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析,三組之間的定量資料采用單因素方差分析的方法進(jìn)行分析,兩組之間的定性資料采用χ~2檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.IS病例組ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P0.05)。2.IS病例組ALOX5AP基因啟動子區(qū)的平均甲基化水平與對照組之間無明顯差異(P0.05),性別分層分析發(fā)現(xiàn)兩組之間也無明顯差異(P0.05)。3.CpG-SNP rs4073259在CpG8位點(diǎn)處呈現(xiàn)了ASM的現(xiàn)象,并且啟動子區(qū)甲基化水平較高的GG基因型個體ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于AG和AA基因型個體(P0.05)。4.用于檢測不同等位基因轉(zhuǎn)錄活性差異的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,攜帶CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)G等位基因重組質(zhì)粒的相對熒光活性顯著低于攜帶A等位基因重組質(zhì)粒的熒光活性(P0.05)。5.IS患者血漿中miR-335、mi R-495的表達(dá)水平顯著低于對照組(P0.05)。6.用于探討miRNA與ALOX5AP基因關(guān)系的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,miR-335、miR-495可以結(jié)合ALOX5AP基因的3’UTR區(qū),調(diào)控該基因的表達(dá)。結(jié)論:1.IS病例組外周血中ALOX5AP基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P0.05)。2.ALOX5AP基因啟動子區(qū)CpG-SNP位點(diǎn)rs4073259通過ASM影響了該基因的表達(dá),從而影響了疾病的表型。3.miR-335、mi R-495在IS患者外周血血漿中表達(dá)下降,并通過結(jié)合ALOX5AP基因的3’UTR區(qū)調(diào)控該基因的表達(dá)。
【圖文】：

圖 1.1 炎癥介質(zhì)白三烯代謝通路圖發(fā)現(xiàn)敲除 ALOX5AP 基因的小鼠，其體了缺血性腦損傷的發(fā)生。許曉偉等[1NA 的表達(dá)水平與腦卒中的關(guān)系，結(jié)果表卒中存在相關(guān)性。本課題組前期應(yīng)用熒例對照者外周血中 ALOX5AP 基因的 mR現(xiàn) IS 組外周血中 ALOX5AP 基因的 mR[13]。（圖 1.2）因此，我們推測 IS 患者水平高于對照組，并可能通過參與動脈

圖 1.1 炎癥介質(zhì)白三烯代謝通路圖[11]研究發(fā)現(xiàn)敲除 ALOX5AP 基因的小鼠，，其體內(nèi) LT減緩了缺血性腦損傷的發(fā)生。許曉偉等[12]在動 mRNA 的表達(dá)水平與腦卒中的關(guān)系，結(jié)果表明 AL壓性腦卒中存在相關(guān)性。本課題組前期應(yīng)用熒光定與 40 例對照者外周血中 ALOX5AP 基因的 mRNA 表結(jié)果發(fā)現(xiàn) IS 組外周血中 ALOX5AP 基因的 mRNA 表<0.05）[13]。（圖 1.2）因此，我們推測 IS 患者外周 表達(dá)水平高于對照組，并可能通過參與動脈壁的炎
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2693190