【摘要】：惡性膠質(zhì)瘤(Malignant Glioma)是一種較為常見(jiàn)且致命的腦部腫瘤,其往往又預(yù)示著患者高發(fā)病率以及高死亡率。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一種較常見(jiàn)的原發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤,其預(yù)后不良。在過(guò)去的十年內(nèi)并沒(méi)有更為有效的治療方法出現(xiàn)。結(jié)合現(xiàn)今的醫(yī)療手段,包括外科手術(shù)治療以及放射治療和化學(xué)藥物治療的應(yīng)用,患者診斷后的生存期望也僅有14個(gè)月左右。膠質(zhì)瘤的基因表達(dá)或大或小的改變,引起了調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成以及轉(zhuǎn)移侵襲的相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的改變。然而,具體的由調(diào)控基因改變引起的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡異常的分子機(jī)制至今尚不明確。因此,詳盡分析這些變化的調(diào)控基因可為膠質(zhì)瘤患者的診斷、預(yù)后以及臨床治療提供新的靶標(biāo)。砷素拮抗蛋白-2(Arsenic-resistance protein-2,Ars2)是由人類(lèi)的SRRT基因編碼的核蛋白。其c DNA的部分片段首次克隆于倉(cāng)鼠細(xì)胞系,當(dāng)時(shí)的研究認(rèn)為Ars2是一種可以拮抗砷鹽毒性的蛋白。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),Ars2也是一個(gè)RNA沉默誘導(dǎo)機(jī)制的影響因子,在果蠅中其與抗病毒能力相關(guān),在哺乳動(dòng)物中則認(rèn)為其與細(xì)胞增殖調(diào)控相關(guān)。通過(guò)多年的研究總結(jié)發(fā)現(xiàn),Ars2蛋白的部分區(qū)段與拮抗砷鹽毒性相關(guān),而其全長(zhǎng)蛋白則通過(guò)調(diào)控RNA代謝調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。同時(shí)Ars2也被認(rèn)為是核內(nèi)帽式結(jié)構(gòu)復(fù)合體CBC(Nuclear Cap-binding Complex)的組分之一,與mi R-155、mi R-21以及l(fā)et-7的生物學(xué)合成相關(guān),并以此調(diào)控細(xì)胞增殖。也就是說(shuō),Ars2的敲降可有效的下調(diào)一些micro RNA(mi RNA)的表達(dá)。最近,學(xué)者發(fā)現(xiàn)Ars2在人類(lèi)的肝癌(Human Hepatocellular Carcinoma,HCC)和膽管細(xì)胞癌(Cholangiocarcinoma)中高表達(dá),并且研究認(rèn)為其可以作為臨床的診斷或預(yù)后指標(biāo),甚至是治療靶標(biāo)。然而卻沒(méi)有直接的證據(jù)指出,Ars2在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮類(lèi)似的作用。在本文的研究中我們發(fā)現(xiàn)Ars2在調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,并且影響了其在體內(nèi)的成瘤能力。功能研究發(fā)現(xiàn),Ars2的敲降會(huì)引起mi RNA-6798-3p的表達(dá)下調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致p53和p21表達(dá)上調(diào),最終引起細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)都將為膠質(zhì)瘤患者的臨床治療提供新視野。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:1.Ars2高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)為確定Ars2是否可以成為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后指標(biāo),研究前期我們通過(guò)查詢(xún)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)R2,利用Kaplan-Meier分析方法對(duì)Frence數(shù)據(jù)庫(kù)的膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。結(jié)果表明,Ars2高表達(dá)患者(78例)的3年存活率為10%,而Ars2低表達(dá)患者(195例)的3年生存率為39%;Ars2高表達(dá)患者的5年存活率為6%,而Ars2低表達(dá)患者的5年生存率為28%。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)Ars2高表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87,LN229,A172,U118,U251),而低表達(dá)于正常人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(normal human astrocytes,HA)。也就是說(shuō)Ars2普遍表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞,而并非是某一種膠質(zhì)瘤的特例。以上結(jié)果表明,在膠質(zhì)瘤患者中,Ars2的高表達(dá)與病人的不良預(yù)后相關(guān)。我們推測(cè)或許Ars2可以作為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。2.Ars2通過(guò)調(diào)控p53/p21信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和LN229中,Ars2的敲降誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。隨后我們又利用Western Blot分析法檢測(cè)Ars2敲降后p53及其下游的p21蛋白的表達(dá)情況,筆者發(fā)現(xiàn)p53與p21的蛋白表達(dá)量顯著增強(qiáng)。此外,利用含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)抑制劑(z-VAD-fmk)處理Ars2敲降的細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡受到明顯抑制。也就是說(shuō)Ars2敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過(guò)caspase路徑實(shí)現(xiàn)的。為排除脫靶效應(yīng),筆者在Ars2敲低的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Ars2并檢測(cè)其對(duì)Ars2敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示在Ars2敲降的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Ars2可抑制細(xì)胞因Ars2敲降誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí)利用si RNA對(duì)敲降A(chǔ)rs2細(xì)胞中的p53以及p21進(jìn)行特異性的干擾,結(jié)果進(jìn)一步證明,Ars2的敲降誘導(dǎo)p53/p21依賴(lài)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3.Ars2通過(guò)mi RNA-6798-3p調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡據(jù)報(bào)道,Ars2在mi RNA的生物學(xué)合成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。所以在后續(xù)的研究過(guò)程中,我們利用了廣州銳博公司提供的高通量mi RNA芯片,比較sh Con-U87與sh Ars2-1#-U87細(xì)胞中的mi RNA的表達(dá)情況,篩選其中表達(dá)下調(diào)倍數(shù)大于2的mi RNA。隨后我們得到了25個(gè)表達(dá)下調(diào)的mi RNA。同時(shí)利用mi RNA的q RT-PCR技術(shù)我們確定了mi RNA-6798-3p在U87和LN229敲降A(chǔ)rs2后表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證mi RNA-6798-3p是否參與到Ars2敲低誘導(dǎo)的U87和LN229細(xì)胞凋亡的過(guò)程中。我們利用mi RNA-6798-3p人工合成產(chǎn)物mi RNA-6798-3p mimic以及流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)檢測(cè)mi RNA-6798-3p對(duì)Ars2敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染mi RNA-6798-3p mimic以及sh Ars2后可以抑制由Ars2敲低誘導(dǎo)的U87和LN229細(xì)胞凋亡。Western Blot結(jié)果也顯示共轉(zhuǎn)染兩者可逆轉(zhuǎn)因Ars2敲低導(dǎo)致的p53、p21以及激活/剪切態(tài)含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(actibation/cleaved-caspase3,C-Caspase3)蛋白表達(dá)的上調(diào)。以上結(jié)果表明,Ars2通過(guò)調(diào)控mi RNA-6798-3p調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。4.Ars2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞原位腫瘤形成能力的影響為驗(yàn)證Ars2的敲低是否在體內(nèi)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,我們構(gòu)建了NOD/SCID鼠原位移植瘤模型。研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)等量原位注射U87-sh Con以及U87-sh Ars2-1#細(xì)胞,對(duì)應(yīng)荷瘤鼠在注射細(xì)胞后的存活時(shí)間分別為42.2±3.9天和82.2±16.5天,且具有顯著性差異。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn),注射sh Con細(xì)胞的NOD/SCID鼠的腦部腫瘤占據(jù)了將近整個(gè)的右半球,而在sh Ars2-1#介入之后腦部腫瘤變得幾乎不可見(jiàn)。為進(jìn)一步的研究Ars2敲低后引起的病理學(xué)變化,通過(guò)HE染色技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)注射sh Con-U87細(xì)胞的NOD/SCID鼠的腦部切片中存在大量的腫瘤細(xì)胞,相反的注射了sh Ars2-1#-U87細(xì)胞的NOD/SCID鼠的腦部切片中幾乎觀測(cè)不到腫瘤細(xì)胞。隨后我們利用免疫組化染色法對(duì)NOD/SCID鼠的大腦進(jìn)行特異性染色,發(fā)現(xiàn)在注射sh Con-U87細(xì)胞后NOD/SCID鼠的大腦有明顯的Ki-67信號(hào),然而在Ars2敲低組內(nèi)NOD/SCID鼠大腦內(nèi)的表達(dá)Ki-67的細(xì)胞較少。為了進(jìn)一步確定Ars2的敲低是否成功,我們同樣的利用免疫組化的方法對(duì)Ars2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,Ars2陽(yáng)性細(xì)胞在sh Ars2-1#組的小鼠大腦切片內(nèi)要明顯少于sh Con組。綜上所述,Ars2可以影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。除此之外,本人還開(kāi)展了麥冬皂苷D(Ophiopogonin D,OP-D)對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬調(diào)控的研究,并獲得如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5.OP-D可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬降解抑制OP-D是一種甾體糖苷,提取自百合科植物麥冬,近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),OP-D可以靶定多條通路進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞增殖。在本文中我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染綠色熒光質(zhì)粒EGFP-LC3,經(jīng)藥物處理后,細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的熒光團(tuán)。利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)調(diào)控蛋白SQSTM1、LC3B、LAMP1以及BECN1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,SQSTM1、LC3B-II以及LAMP1會(huì)隨著OP-D濃度以及作用時(shí)間的累積而增強(qiáng),而B(niǎo)ECN1的表達(dá)卻沒(méi)有變化。同時(shí)共處理細(xì)胞自噬降解抑制劑Bafilomycin A1(Baf)和細(xì)胞自噬激動(dòng)劑Rapamycin(Rapa)結(jié)果顯示,OP-D的作用與Baf作用類(lèi)似。也就是說(shuō)OP-D抑制了乳腺癌細(xì)胞自噬降解過(guò)程。6.OP-D可以通過(guò)抑制微管蛋白α-Tubulin乙酰化進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬降解根據(jù)EGFP-LC3轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,OP-D處理乳腺癌細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的自噬體呈現(xiàn)分散狀態(tài)而非聚集狀態(tài),我們推測(cè)細(xì)胞微管蛋白α-Tubulin發(fā)生變化。通過(guò)Western blot分析法我們確定α-Tubulin的乙酰化受阻。也就是說(shuō)OP-D是通過(guò)抑制微管蛋白乙酰化進(jìn)而抑制了乳腺癌細(xì)胞自噬降解。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4

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