【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)旨在通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TMEM106B對(duì)惡性腦膜瘤細(xì)胞增殖和血管生成的影響,并探討其可能分子機(jī)制。方法:1.干擾惡性腦膜瘤IOMM-Lee和CH157兩種細(xì)胞株TMEM106B基因,每組細(xì)胞株分為三組:干擾TMEM106B為實(shí)驗(yàn)組(TMEM106B-sh),轉(zhuǎn)染無關(guān)序列慢病毒為陰性對(duì)照組(NC-sh),空白對(duì)照組(Blank),使用q-PCR、Western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞TMEM106B mRNA和蛋白表達(dá)水平。2.體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)繪制IOMM-LEE、CH157兩種惡性腦膜瘤細(xì)胞株瘤體生長-時(shí)間曲線,計(jì)算抑瘤率,并且通過免疫組化法檢測(cè)各組瘤體中ki-67和VEGF的表達(dá)情況,并通過標(biāo)記CD34來計(jì)算其微血管密度(MVD),比較各組細(xì)胞增殖和血管生成能力。3.通用軟件預(yù)測(cè)分析TMEM106B基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子JUN之間的結(jié)合位點(diǎn),并構(gòu)建TMEM106B報(bào)告基因野生型、突變型質(zhì)粒及轉(zhuǎn)錄因子JUN的過表達(dá)質(zhì)粒,通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子JUN是否能與TMEM106B啟動(dòng)子特異性結(jié)合。4.染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證TMEM106B基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子JUN之間是否有特異性的結(jié)合。結(jié)果:1.通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾TMEM106B基因的表達(dá)后,q-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)惡性腦膜瘤細(xì)胞株中TMEM106B的蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯下降,達(dá)到分組要求。2.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,在TMEM106B-sh組,裸鼠成瘤的能力減弱,瘤體增殖的速度減慢,免疫組化染色結(jié)果顯示TMEM106B、ki-67、VEGF表達(dá)水平均明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。標(biāo)記各組CD34的表達(dá)水平分析各組的微血管密度(MVD),結(jié)果顯示干擾TMEM106B后,MVD降低。3.軟件預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示:TMEM106B基因啟動(dòng)子區(qū)上有7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子JUN的結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄因子JUN能與TMEM106B啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合。4.染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TMEM106B啟動(dòng)子能與轉(zhuǎn)錄因子JUN結(jié)合。結(jié)論:1.干擾TMEM106B后可以抑制惡性腦膜瘤的增殖和血管生成;2.MEM106B啟動(dòng)子區(qū)存在與轉(zhuǎn)錄因子JUN結(jié)合的特異性位點(diǎn),說明TMEM106B可能受JUN的調(diào)控影響惡性腦膜瘤的增殖與血管生成。
【圖文】：

圖2-1：Q-PCR檢測(cè)兩株惡性腦膜瘤細(xì)胞株TMEM106B基因 mRNA的表達(dá)水平（**P＜0.01，***P＜0.005）2.2.3 Western blot 檢測(cè)惡性腦膜瘤細(xì)胞 TMEM106B 基因蛋白的表達(dá)情況提取各組蛋白進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，結(jié)果如下圖（圖 2-2）所示，說明在IOMM-LEE 細(xì)胞株、CH157 兩株細(xì)胞株中，沉默 TMEM106B 后 TMEM106B 蛋白表達(dá)量均下降，IOMM-Lee細(xì)胞株下降約53.9%，CH157細(xì)胞株下降約55.6%，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

EM106B 基因后對(duì)惡性腦膜瘤細(xì)胞增殖和血管生成的影響23圖2-2: Western blot檢測(cè)兩株細(xì)胞株TMEM106B基因蛋白表達(dá)水平（**P＜0.01，***P<0.005）2.2.4 裸鼠的生長-時(shí)間曲線接種惡性腦膜瘤第 6 天后，各組裸鼠均可在腋下觸及實(shí)性包塊，幾天后包塊未消失，裸鼠成瘤率為 100%，無自然死亡。記錄裸鼠瘤體的 a 值、b 值，計(jì)算體積，結(jié)果顯示：裸鼠成瘤第 6 天開始，各組之間的體積出現(xiàn)的變化，兩株細(xì)胞株中 TMEM106B-sh 組與 NC-sh 組比較
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.45

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2680212