【摘要】：背景:威爾遜氏癥(WD),ATP7B基因突變引起的罕見的銅代謝障礙的常染色體隱性遺傳病。除肝臟,神經癥狀外,較低的骨密度是WD的另一個最常見的臨床特征,但其潛在的機制尚未完全了解。誘導多能干細胞(iPSCs),有著自我更新、生長迅速、可分化為身體各組織器官的潛能且與胚胎干細胞相比沒有倫理宗教法律的限制等優(yōu)點�；谶@些優(yōu)點,摻入基因治療的iPSCs可以通過體外培養(yǎng)建立一些疾病如威爾遜氏癥的細胞模型,進而為相應疾病的治療提供新的思路與方法。目的:探究威爾遜氏癥骨密度低的原因;初步探究威爾遜氏癥低成骨活性的機制;篩選小分子促進威爾遜氏癥的成骨分化。方法:通過擬胚體(EBs)形成以及添加成骨培養(yǎng)基的方法進行正常和WD iPSCs的成骨誘導并通過熒光實時定量以及茜素紅染色從基因型以及表型兩方面比較正常對照組和威爾遜氏癥組之間成骨表達是否有差異;通過轉錄組測序技術分析威爾遜氏癥和正常iPSCs誘導的成骨細胞的基因表達譜,進而比較正常對照組和威爾遜氏癥組之間的差異基因并推測威爾遜氏癥組的低成骨活性可能是通過β-catenin途徑影響成骨細胞分化的,然后進一步通過免疫蛋白印跡和免疫熒光驗證上述推測;最后通過篩選小分子發(fā)現SKL2001這個小分子化合物可通過破壞β-catenin/Axin之間的相互作用,穩(wěn)定細胞內β-catenin蛋白。進而我們通過實時定量以及免疫蛋白印記、免疫熒光驗證SKL2001是否可以促進威爾遜氏癥組的成骨分化。結果:通過擬胚體(EBs)形成以及添加成骨培養(yǎng)基的方法進行正常和WD iPSCs的成骨誘導并得到在成骨分化的所有階段中威爾遜氏癥成骨細胞中的成骨標志物基因的表達顯著低于正常對照組,并且威爾遜氏癥成骨細胞中的礦化水平也顯著低于正常對照組;通過轉錄組測序分析得到來自威爾遜氏癥的成骨細胞和健康對照之間β-catenin途徑存在顯著差異,推測威爾遜氏癥的低成骨活性可能是通過β-catenin途徑影響成骨細胞分化的。然后通過免疫蛋白印記和免疫熒光得到在iPSCs階段以及在成骨誘導各階段,威爾遜氏癥組的β-catenin的總蛋白的表達略低于正常對照組β-catenin的總蛋白的表達,以及在成骨誘導7天以及21天時,威爾遜氏癥組的胞核蛋白中β-catenin的表達也都略低于正常對照組,進而可得到威爾遜氏癥的低成骨活性可能與異常的β-catenin途徑有關;最后通過查閱文獻篩選出了一個小分子藥物SKL2001,可通過破壞β-catenin/axin之間的相互作用,穩(wěn)定細胞內β-catenin蛋白。通過熒光實時定量證明了加入小分子SKL2001處理組成骨細胞的成骨標志性基因的表達較未加入小分子SKL2001處理組成骨細胞的成骨標志性基因的表達有升高,通過免疫蛋白印記以及免疫熒光證明了加入小分子SKL2001處理組成骨細胞β-catenin的表達較未加入小分子SKL2001處理組成骨細胞中的β-catenin的表達向細胞核的轉移增加,核蛋白的表達升高,進而激活了下游轉錄。但卻沒有劑量依賴性。結論:在本課題中,通過擬胚體(EBs)形成以及添加成骨培養(yǎng)基的方法進行正常和WD iPSCs的成骨誘導并通過與正常對照組比較首次發(fā)現了WD-iPSCs衍生的成骨細胞表現出比正常對照組更低的成骨活性。進一步通過基因表達譜的分析,總蛋白和胞核蛋白中β-catenin的檢測以及β-catenin的核定位情況,我們鑒定并驗證了威爾遜氏癥組中低成骨活性可能是由于異常的β-catenin途徑所致。最后,通過加入小分子SKL2001處理組與未處理組的比較得到小分子SKL2001可以通過破壞Axin/β-catenin復合物的形成,促進β-catenin的表達量以及向細胞核的轉移增加,促進威爾遜氏癥組的成骨分化,改善威爾遜氏癥骨密度低的現狀。因此,我們的上述研究結果表明,威爾遜氏癥患者骨密度低和骨質疏松可能是由于異常β-catenin信號通路引起的成骨減少,這些威爾遜氏癥患者可能受益于β-catenin靶向策略,以改善骨重建的不平衡。
【圖文】：

圖 1 基于 iPSCs 的正常對照和威爾遜氏癥的成骨誘導Fig.1 Osteogenesis induction from both normal and WD iPSCs was performed(Scale bar represents 500μm)1.2.2 RT-qPCR 檢測成骨標志性基因的表達正常對照組的 iPSCs 和威爾遜氏癥的 iPSCs 在經過上述的細胞培養(yǎng)以及成骨誘導后得到的成骨細胞，trizol 試劑分別收集兩者定向分化 7 天、14 天以及 21 天的成骨細胞中的 RNA，并且經過 RNA 的提取，cDNA 的逆轉錄以及 RT-qPCR 的檢測，比較兩者的成骨標志基因的表達差異，進而初步判斷威爾遜氏癥的骨密度降低是否與成骨有關。其中control 為正常對照組，WD 為威爾遜氏癥組。圖 2 為兩者定向分化 7 天、14 天以及 21天時成骨細胞成骨標志性基因表達的差異圖，如圖所示，在誘導 7 天的時候，與正常對照相比，OCN，RUNX2 以及 COL1A1 在 WD 組成骨標志基因的表達約低 2 倍，在誘導14 天的時候，ALP 和 RUNX2 在 WD 組成骨標志基因的表達比正常對照組約低 6 倍，COL1A1 約低 4 倍，雖然 OCN 的差異并沒有 ALP，RUNX2，以及 COL1A1 的差異大，

T-qPCR 檢測威爾遜氏癥組以及正常對照組成骨細胞的成骨標志性基因的-PCR detect the expression of the osteogenic marker gene in the normal contro(*P < 0.05)染色檢測磷酸鹽堆積組的iPSCs和威爾遜氏癥的iPSCs在經過上述的細胞培養(yǎng)以及成細胞，通過進行茜素紅染色，檢測其礦化能力。結果如圖 3 所示骨誘導 51 天后礦化結節(jié)的圖，，下圖為威爾遜氏癥組成骨誘導 51出在同樣的階段時，正常對照組相對于威爾遜氏癥組經過茜素紅顯的紅色的礦化結節(jié)并且顆粒比較大，密度也比較大，而威爾遜較少近乎沒有，并且且顆粒較小，由此可看出在礦化末期，健康爾遜氏癥組多且大，即威爾遜氏癥組的礦化水平低于正常對照。
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.4

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1 張大達;;威爾遜氏癥在細胞培養(yǎng)中的遺傳表達:一個診斷的記號[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1981年01期

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1 劉靜;基于iPSCs的疾病細胞模型探究威爾遜氏癥成骨過程中β-catenin通路的異常[D];濟南大學;2019年

本文編號：2657590