【摘要】：小神經膠質細胞作為中樞神經系統中的主要免疫細胞,具有分化狀態(tài)與功能的高度可塑性。它們不僅在維持中樞神經系統穩(wěn)態(tài)中的作用十分關鍵,而且參與多種神經相關疾病的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明,小神經膠質細胞的形態(tài)和動態(tài)行為是其在不同生理與病理條件下分化狀態(tài)的直觀反映。使用活體顯微成像技術,描繪小神經膠質細胞形態(tài)和動態(tài)行為的變化規(guī)律,將為直觀地揭示其在不同疾病中的作用帶來可能。目前,癌癥威脅著人類的健康,而腫瘤轉移是癌癥極難根治的主要原因。由于腦結構及功能的復雜性,腫瘤腦轉移具有治療難度大、風險高、預后不良的特點。神經病理性疼痛是一種主要由神經系統損傷造成的慢性疼痛,在一些慢性疾病(如癌癥中的骨縮、感染、自身免疫疾病、外傷、糖尿病等)的發(fā)展過程中也會伴隨發(fā)生,極大地影響了病人的生活質量。然而,在這兩種疾病的漫長發(fā)展過程中,小神經膠質細胞的分化狀態(tài)是如何改變的,并且發(fā)揮怎樣的功能,目前還并不清楚。本研究充分利用活體顯微成像方法的優(yōu)勢,旨在對腫瘤腦轉移及神經病理性疼痛這兩種慢性疾病中小神經膠質細胞的形態(tài)和動態(tài)行為進行長時程監(jiān)視,以期揭示其在這兩種疾病發(fā)展中所發(fā)揮的作用。主要結果如下所示:(1)首先,我們通過雙側顱窗窗口實現了對小鼠黑色素瘤腦轉移灶和正常腦組織的同時監(jiān)視。經過長達3周的活體顯微成像,我們觀察到在黑色素瘤腦轉移的發(fā)展過程中小神經膠質細胞的形態(tài)由靜息狀態(tài)下的典型分支狀轉變?yōu)榛罨淖冃蜗x樣。成像數據的定量分析結果顯示相比正常腦組織,轉移灶中的小神經膠質細胞的胞體直徑增至其1.56倍,而細胞突起長度減少了1.68倍。這些細胞除了形態(tài)發(fā)生了變化外,細胞的數量及胞體的運動速度分別是對照組的1.57倍和2.36倍。此外我們綜合小神經膠質細胞的胞體直徑及細胞突起長度信息,提出了可更直觀與全面反映小神經膠質細胞活化程度的參數“分支參數”。這些結果說明在腫瘤細胞接種后的第5天開始,大量的小神經膠質細胞已被活化,且隨著腫瘤轉移灶的發(fā)展至接種后第21天,它們始終保持著這一活化狀態(tài),且活化程度達到最高。(2)通過剔除小神經膠質細胞,我們證實它們參與了黑色素瘤腦轉移灶的形成。同時這些小神經膠質細胞在黑色素瘤腦轉移的發(fā)展中顯著上調了MMP3的表達。其中,高達94%的小神經膠質細胞表達了MMP3,且相對腫瘤細胞,小神經膠質細胞表達的MMP3是其114.2倍。小神經膠質細胞MMP3表達情況與血腦屏障完整性及小神經膠質細胞活化參數的相關性分析顯示,這些MMP3一方面作為刺激分子促進了小神經膠質細胞的活化,另一方面也參與破壞血腦屏障完整性從而實現對黑色素瘤腦轉移發(fā)展的促進作用。(3)通過坐骨神經CCI損傷,建立了不同程度疼痛的小鼠模型,在實現腰椎L5段的脊髓窗安裝后,經過長達2周的脊髓成像,我們觀察到小神經膠質細胞在神經病理性疼痛發(fā)展中的動態(tài)變化。通過比較不同程度疼痛小鼠及疼痛小鼠左右兩側脊髓段中的小神經膠質細胞,我們發(fā)現,中重度疼痛小鼠脊髓中,小神經膠質細胞在疼痛損傷后第2天已開始活化,它們的形態(tài)更傾向于變形蟲樣。而且至疼痛損傷后第14天,這些細胞仍然保持著活化的狀態(tài),同時,細胞突起的運動速度降低,單位體積細胞數量是對照組的1.75倍。這些結果說明,疼痛損傷后,小神經膠質細胞能快速被活化,且疼痛發(fā)展過程中小神經膠質細胞持續(xù)的活化狀態(tài)提示其與神經病理性疼痛的發(fā)展持久且漫長的特點密切相關。(4)最后,為了探究后肢感覺皮層是如何參與神經病理性疼痛的調控,通過無標記、高分辨的光聲顯微成像系統,我們對正常小鼠和疼痛小鼠的后肢感覺皮層血氧飽和度進行了成像,結果顯示疼痛小鼠皮層血管中含氧血紅蛋白的比例更高。血氧飽和度更高的現象說明,在疼痛小鼠中,后肢感覺皮層中正在進行活躍的物質和能量交換,因此需要更多的氧分,并提示皮層中小神經膠質細胞也可能處于活化的狀態(tài),從而參與了神經病理性疼痛的調控。綜上所述,本課題使用活體顯微成像技術監(jiān)測到,隨著黑色素瘤腦轉移及神經病理性疼痛的發(fā)展,小神經膠質細胞能夠被快速地活化,且在形態(tài)、動態(tài)行為及分布上有了顯著性的改變,并通過傳統生物學手段及光聲顯微成像技術,進一步揭示了其在這兩種疾病中的作用,為相關機理研究提供了新證據,并為這兩種疾病的治療提供了新思路。
【圖文】：

io-Hortega 發(fā)現的小神經膠質細胞。A，Pio del Rio-Hortega（1882-1945）；B，Rio-Ho支裝小神經膠質細胞；C，吞噬過程中小神經膠質細胞的形態(tài)變化（A，具有粗大的；B，短小的細胞突起和膨大的胞體；C，肥大胞體及偽足；D 和 E，變形蟲樣及偽足了白細胞；G，吞噬了紅細胞；H，脂肪滴細胞，I，正在進行有絲分裂的細胞）31。-1 Microglia discovered by Pio del Rio-Hortega. A, Pio del Rio-Hortega (1882-1945d microglia drawn by Pio del Rio-Hortega. C, Different morphology of microglia durintic activity (A, cell with thick, rough prolongations; B, cells with short prolongations cell body; C, hypertrophic cell with pseudopodia; D and E, amoeboid and pseudopodic form phagocytosed leukocyte; G, cell with numerous phagocytosed erythrocytes; H, fat-granule mitotic division)31.神經膠質細胞活化狀態(tài)與功能密切相關�；谠缙谌藗儗π∩窠浤z質細胞功發(fā)現，小神經膠質細胞能在外界刺激下轉變成具有某種特定功能的活化細形態(tài)會發(fā)生顯著性的改變32。隨著顯微成像技術的發(fā)展，人們觀察到活化的質細胞相比監(jiān)視狀態(tài)下的細胞，運動等動態(tài)行為也有顯著性的差別33。它們態(tài)和動態(tài)的變化，都能夠作為評價小神經膠質細胞活化狀態(tài)的標準。在 2el Nimmerjahn34等人在健康的小鼠腦組織中發(fā)現，小神經膠質細胞是高速動圖 1-2 所示。它們通過其高度分支的細胞突起通過伸出和回縮持續(xù)掃描周圍

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文，并讓人們意識到其動態(tài)的重要性。在隨后的研究中，不少研究者成像的方法揭示了小神經膠質細胞在不同微環(huán)境中的作用35-38，如傷的腦組織活體顯微成像發(fā)現，小神經膠質細胞這種對損傷做出的應是依賴于 ATP 的；通過對中風的小鼠腦組織進行成像發(fā)現，小神擇性地清除功能紊亂的神經元網絡從而實現對腦組織的保護；而在育過程中，小神經膠質細胞能夠誘導突觸的形成；另外，通過對單長達 15 個月的成像發(fā)現，其在腦組織中的較長的生命周期與各種都有緊密聯系。這些活體顯微成像的結果揭示了小神經膠質細胞動腦組織微環(huán)境中的變化，從而實現正常監(jiān)視或損傷修復和應急，，調化疾病發(fā)生發(fā)展等功能。因此，小神經膠質細胞的形態(tài)及動態(tài)的變化狀態(tài)的改變。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5;R741

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