【摘要】：研究背景膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,雖然手術(shù)結(jié)合放化療的治療方式已經(jīng)很成熟,但預(yù)后一直很差。其中惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5年生存率僅為5.5%,具有高致死率和高復(fù)發(fā)率的特點,這很大程度上是因為膠質(zhì)瘤具有高度的異質(zhì)性。膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性包括腫瘤間的異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。不同膠質(zhì)瘤患者來源的腫瘤組織可以分為不同的形態(tài)病理學(xué)亞型或者分子亞型,而同一患者的腫瘤組織也可以根據(jù)位置不同能被分為不同的形態(tài)病理學(xué)亞型或者分子亞型。高度的異質(zhì)性被認(rèn)為是高級別膠質(zhì)瘤抗藥性和高復(fù)發(fā)率的主要原因,也成為了膠質(zhì)瘤治療的一個瓶頸。腫瘤干細(xì)胞概念的提出對于應(yīng)對膠質(zhì)瘤異質(zhì)性的挑戰(zhàn)提供了希望。由于腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為能夠起始和重建腫瘤異質(zhì)性且對放化療等治療措施表現(xiàn)出明顯的耐受性,因此被視作腫瘤發(fā)生、演進(jìn)以及遷移復(fù)發(fā)的種子和首選的靶向治療目標(biāo),成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的熱點。然而,目前對腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞身份還不明確,因此阻礙了其在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和臨床治療上的應(yīng)用。而找到腫瘤細(xì)胞起源被認(rèn)為是理解腫瘤異質(zhì)性很重要的一個方面,也為設(shè)計膠質(zhì)瘤新的治療方案帶來了希望。我們團隊和其他研究團隊利用小鼠遺傳學(xué)膠質(zhì)瘤模型的研究結(jié)果提示,少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(以下簡稱“OPC”,膠質(zhì)細(xì)胞的一種類型)在惡性膠質(zhì)瘤中扮演了一個重要的細(xì)胞起源角色。我們最近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),OPC起源的小鼠膠質(zhì)瘤中存在OPC樣的腫瘤細(xì)胞,這些細(xì)胞來源于正常OPC,又具有腫瘤干細(xì)胞的特征,在體外能增殖和分化,移植到小鼠腦中又能起始腫瘤。利用福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本,我們發(fā)現(xiàn)Olig2陽性的腫瘤細(xì)胞亞群廣泛存在于不同級別的膠質(zhì)瘤患者中,這些細(xì)胞同時作為腫瘤中主要的增殖細(xì)胞類群。鑒于Olig2是正常大腦中OPC 一個穩(wěn)定的細(xì)胞標(biāo)志物,我們觀察到的這些結(jié)果至少提示了Olig2陽性的腫瘤細(xì)胞亞群也許和正常OPC具有一些相似的特征。因此,這些OPC樣的腫瘤細(xì)胞可能在人膠質(zhì)瘤中扮演了重要的角色,深入剖析膠質(zhì)瘤中這類細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征和生物學(xué)功能,對膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化都具有重大的意義。研究目的:探究OPC樣腫瘤細(xì)胞在人不同級別膠質(zhì)瘤中的細(xì)胞身份、形態(tài)、分布等細(xì)胞特征,以及具有哪些生物學(xué)功能,與膠質(zhì)瘤惡性程度、異質(zhì)性、亞型、腫瘤干細(xì)胞之間的關(guān)系。研究方法:(1)、建立適合高分辨率組化分析的人膠質(zhì)瘤冰凍組織樣本庫,去除人腦組織中的自發(fā)熒光,建立針對人腦(正常或腫瘤)組織的多重免疫熒光染色分析方法。(2)、選取不同級別(Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級)人膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行多重免疫熒光染色分析,觀察OPC特征性標(biāo)志物Olig2、PDGFRa、NG2、Sox10等共表達(dá)情況,及其與增殖細(xì)胞標(biāo)志物Ki67、干細(xì)胞標(biāo)志物Sox2、星形細(xì)胞標(biāo)志物GFAP等的共染情況。進(jìn)行統(tǒng)計分析,計算OPC樣腫瘤細(xì)胞的分布、增殖比例等。(3)、建立人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系,觀察OPC樣腫瘤細(xì)胞在原代培養(yǎng)細(xì)胞系中以及小鼠移植瘤模型中的特征。(4)、建立從人膠質(zhì)瘤新鮮組織中分離純化OPC樣腫瘤細(xì)胞的實驗方法“免疫富集”(Immunopanning),用RT-PCR和RNA轉(zhuǎn)錄組測序的方法對“OPC樣細(xì)胞”和“非OPC樣細(xì)胞”進(jìn)行分析,一方面驗證“免疫富集”(Immunopanning)方法的可靠性和實用性,另一方面從RNA轉(zhuǎn)錄組水平觀察OPC樣腫瘤細(xì)胞的特征。(5)、對純化得到的“OPC樣細(xì)胞”和“非OPC樣細(xì)胞”進(jìn)行體外成球?qū)嶒?細(xì)胞增殖分化能力的實驗,探究OPC樣腫瘤細(xì)胞在體外是否具有干細(xì)胞的特性。(6)、將純化得到的“OPC樣細(xì)胞”和“非OPC樣細(xì)胞”分別原位移植到免疫缺陷小鼠腦子里,觀察各自起始腫瘤的能力,以此探究OPC樣腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)是否具有干細(xì)胞的特性起始腫瘤。研究結(jié)果:(1)、成功建立了 一個適合高分辨率組化分析的人腦(正�；蚰[瘤)冰凍標(biāo)本庫,并且成功建立了一套穩(wěn)定的針對人腦(正�；蚰[瘤)組織的多重免疫熒光染色分析方法。(2)、多重免疫熒光染色分析結(jié)果顯示,不同級別人膠質(zhì)瘤中有40～50%細(xì)胞是Olig2陽性的,這一個細(xì)胞類群中有30～40%左右同時表達(dá)了 OPC高度特意的細(xì)胞標(biāo)志物PDGFRa,具有OPC的特征;在增殖分裂(Ki67陽性)的細(xì)胞中,Olig2和PDGFRa共陽性的細(xì)胞占了 30～50%;幾乎所有的PDGFRa陽性細(xì)胞都是Olig2陽性的,也是Sox2陽性的,Sox2是表征干細(xì)胞的一個標(biāo)志物。(3)、成功建立人膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)體系,同時發(fā)現(xiàn)OPC樣腫瘤細(xì)胞存在于原代培養(yǎng)后的細(xì)胞系中以及小鼠移植瘤模型中,并維持了活躍增殖的能力。(4)、成功建立一個從人膠質(zhì)瘤新鮮組織中穩(wěn)定地分離純化OPC樣腫瘤細(xì)胞的實驗方法“免疫富集”(Immunopanning)。RT-PCR的結(jié)果顯示,相比“未純化細(xì)胞”和“非OPC樣細(xì)胞”,“OPC樣細(xì)胞”表達(dá)了更高水平的正常OPC特征基因包括PDGFRa、Olig2、NG2、NKX2.2。RNA轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)顯示,相比“非OPC樣細(xì)胞”,“OPC樣細(xì)胞”表達(dá)了更高水平的其它一些正常OPC特征基因包括PDGFRa、NG2、SOX10、DLL3、PLP1、CLDN11、MBP。單樣本基因集富集分析(ssGSEA)分析結(jié)果顯示“OPC樣細(xì)胞”相比“非OPC樣細(xì)胞”富集了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤前神經(jīng)元亞型的特征基因。(5)、體外實驗結(jié)果顯示,從人膠質(zhì)瘤新鮮組織中純化下來的OPC樣腫瘤細(xì)胞在具有體外成球的能力,而且具有增殖分裂的能力。研究結(jié)論:OPC樣腫瘤細(xì)胞廣泛存在于不同級別膠質(zhì)瘤患者中,是一類重要的增殖細(xì)胞類群,具有腫瘤干細(xì)胞的特性,可能在人膠質(zhì)瘤中扮演了非常重要的角色。
【圖文】：

我們采用高分辨率的多重免疫熒光染色方法來對肢質(zhì)瘤冰凍組織進(jìn)行逡逑組化分析，但我們又發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤組織中存在著大量的自發(fā)熒光，而且這些自發(fā)逡逑熒光信號在所有常用的四個熒光通道中都存在（見圖２ｄ），該自發(fā)熒光信號嚴(yán)重干逡逑擾了特異性熒光抗體的信號。為了搞清楚該自發(fā)熒光信號是人膠質(zhì)瘤組織在腫瘤逡逑發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的，還是人腦組織本身就存在的一種熒光物質(zhì)？我們利用正逡逑常人腦冰凍樣本進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)同樣也存在著廣泛的自發(fā)熒光現(xiàn)象（見圖２ｃ）。這逡逑一發(fā)現(xiàn)使得免疫熒光染色的研究變得極其復(fù)雜和困難，這不僅是對于我們研究人逡逑肢質(zhì)瘤腫瘤組織，也對整個神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究正常人腦組織產(chǎn)生了極大的影響，逡逑因此必須得到系統(tǒng)穩(wěn)定的解決。逡逑２０逡逑

生影響？目前還沒有一個量化的評估。逡逑通過測試一系列的實驗參數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，，蘇丹黑Ｂ的染色確實能有效去除人逡逑腦冰凍組織中的自發(fā)熒光（比較圖３ａ和３ｂ，見圖４）。在測試的過程中我們也發(fā)逡逑現(xiàn)，當(dāng)蘇丹黑Ｂ的濃度低于０．３％時，人腦冰凍俎織樣本中的自發(fā)q捁獠荒鼙煌耆義先コ�；蠂看，当吮Kず冢碌吶ǘ卻锏劍埃常ナ�，自发荧箯T藕拍鼙煌耆コ�。謾n緬義獻(xiàn)⒁獾氖牽彼盞ず冢碌吶ǘ仍冢埃埃保セ蛘擼埃保ナ�，随着Ｐn踴撼逡浩創(chuàng)問膩義顯齠�，被去除的自发荧箯T藕龐殖魷至�，这提示晤U撬盞ず冢率峭ü贍嫻亟岷襄義嫌廡藕爬慈コ苑⒂獾模ㄍ跡矗�。这一实验结果为晤U塹難芯看戳訟Ｍ�，于辶x鮮俏頤墻徊酵ü笛槔刺驕克盞ず冢碌娜舊欠窕岫悅庖哂餿舊跋歟義銜頤搶瞇∈竽宰櫓城釁校埃保椋紓插澹ㄉ僂喚褐氏赴紫當(dāng)澩锏囊桓鱟家蜃渝義希郟擔(dān)罰藎┑拿庖哂餿舊�，并设立鏅壴片，一组经过去除自发荧光的实验步骤，另辶x弦蛔椴瘓貌街

本文編號：2614191