【摘要】：作為細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解途徑,泛素蛋白酶系統(tǒng)(UbiquitinProteasome System,UPS)包括26S蛋白酶體、去泛素化酶(Deubiquitinase,DUBs)'泛素分子、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3。DUBs是一組能夠水解泛素羧基端的酯鍵、肽鍵和異肽鍵并將泛素分子從蛋白質(zhì)上移除的蛋白酶家族。泛素竣基端水解酶 L5(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5,UCH-L5)是去泛素化酶家族成員之一。UCH-L5通過(guò)從多聚泛素鏈的遠(yuǎn)端亞基逐個(gè)去除泛素分子,對(duì)于蛋白降解的調(diào)節(jié)具有雙重性,一方面通過(guò)移除標(biāo)記蛋白的泛素分子從而抑制蛋白降解;另一方面通過(guò)適當(dāng)移除泛素分子從而使得被泛素標(biāo)記的蛋白具有有利于進(jìn)入蛋白酶體的構(gòu)象從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。當(dāng)UCH-L5結(jié)合蛋白酶體19S調(diào)節(jié)亞基的Rpn13/Admr1受體時(shí),UCH-L5活性增強(qiáng);當(dāng)UCH-L5與INO80復(fù)合物的NFRKB亞基結(jié)合時(shí),其活性受到抑制。但是UCH-L5在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究對(duì)19例冷凍和51例石蠟包埋的臨床病理切片進(jìn)行分析,結(jié)果表明與正常腦組織相比,UCH-L5在腦膠質(zhì)瘤組織中呈低表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中,UCH-L5可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG、U251細(xì)胞的遷移和侵襲功能。我們選擇SNRPN,SNRPF和CKLF作為UCH-L5的靶向候選基因,該三種基因已被證明在膠質(zhì)瘤或其他腫瘤中異常表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn),干擾SNRPF,SNRPN或CKLF的表達(dá)可抑制U87MG細(xì)胞的遷移和侵襲能力;而干擾UCH-L5的表達(dá)可上調(diào)SNRPF的mRNA和蛋白水平,并且UCH-L5調(diào)節(jié)SNRPF在遷移和侵襲的功能在U87MG細(xì)胞得到了進(jìn)一步證實(shí),隨后在293T細(xì)胞中證實(shí)UCH-L5過(guò)表達(dá)可以下調(diào)SNRPF蛋白水平,因此本研究認(rèn)為UCH-L5通過(guò)下調(diào)SNRPF從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲功能。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)UCH-L5可以下調(diào)包括SNRPF等8種基因在內(nèi)的Sm家族的mRNA水平表達(dá)。UCH-L5的活性受NFRKB調(diào)節(jié),我們發(fā)現(xiàn)在U87MG和U251 細(xì)胞中,NFRKB-siRNA 影響 UCH-L5 和 SNRPF 的 mRNA 水平,NFRKB-siRNA下調(diào)SNRPF的mRNA水平,因此我們推測(cè),UCH-L5調(diào)節(jié)SNRPF的mRNA的表達(dá)可能受到NFRKB的調(diào)節(jié)。目前UCH-L5在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的具體作用和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明,因此,進(jìn)一步研究UCH-L5的生物學(xué)功能能夠?yàn)橄嚓P(guān)疾病的治療提供新的思路,具有重要的臨床意義。
【圖文】：

ｑＰＣＲ技術(shù)分析樣本中的ＵＣＨ－Ｌ５水平，３例正常腦組織和隨機(jī)選取的５例腦膠質(zhì)逡逑經(jīng)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技術(shù)分析ＵＣＨ－Ｌ５的蛋白水平。結(jié)果表明：與正常腦組織相比，，逡逑ＵＣＨ－Ｌ５的ｍＲＮＡ水平（圖３．１Ａ）和蛋白質(zhì)水平（圖３．１Ｂ）在腦肢質(zhì)瘤組織中水逡逑平較低。我們將４例正常腦組織和４７例膠質(zhì)瘤組織做成組織芯片（ＴＭＡ），進(jìn)行逡逑免疫組化實(shí)驗(yàn)，上述正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤組織中ＵＣＨ－Ｌ５的表達(dá)差異經(jīng)免疫組逡逑化得到進(jìn)一步證明（圖３．１Ｃ）。這些結(jié)果表明，腦組織中ＵＣＨ－Ｌ５低表達(dá)與膠質(zhì)瘤逡逑的發(fā)生呈正相關(guān)，但在低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別膠質(zhì)瘤之間無(wú)差異（圖３．１Ｃ）。表１逡逑和表２顯示冷凍樣本和石蠟包埋樣品的詳細(xì)資料，包括數(shù)目、腫瘤級(jí)別、腫瘤類逡逑型和病人年齡。逡逑１４逡逑

病毒的感染效率經(jīng)檢測(cè)ＧＦＰ表達(dá)率證明均超過(guò)９０％。穩(wěn)定干擾和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)逡逑ＵＣＨ－Ｌ５的單克隆細(xì)胞通過(guò)嘌呤霉素進(jìn)行篩選得到并作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)材料。慢病毒逡逑介導(dǎo)的穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)效率在Ｕ８７ＭＧ細(xì)胞中分別為７０％和２倍（圖３．８Ａ）。慢逡逑病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)效率在Ｕ２５１細(xì)胞中分別為６０％和３倍（圖３．８Ｂ）。逡逑相應(yīng)地，我們發(fā)現(xiàn)ＵＣＨ－Ｌ５顯著抑制Ｕ８７ＭＧ細(xì)胞（圖３．８Ｃ和圖３．８Ｅ）和Ｕ２５１逡逑細(xì)胞（圖３．８Ｄ和圖３．８Ｆ）中ＳＮＲＰＦ的ｍＲＮＡ和蛋白水平的表達(dá)。逡逑２８逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2607619