發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 07:06

【摘要】：研究背景和目的:神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童時(shí)期常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤,高�；純侯A(yù)后差,積極綜合治療長(zhǎng)期存活率仍然較低,增加化療強(qiáng)度,并沒(méi)有顯著地改善高�；純旱拈L(zhǎng)期生存狀況,而且大劑量的化療藥物可能會(huì)對(duì)患兒產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。減少化療藥物劑量不能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)衰老而暫時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞地惡性增殖,同時(shí)降低相關(guān)毒副作用。本實(shí)驗(yàn)擬探討小劑量化療藥物順鉑是否能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老及其作用機(jī)制。研究方法:選擇NMYC基因擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(IMR32)為研究對(duì)象,利用噻唑藍(lán)比色法(MTT)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的順鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響。利用顯微鏡觀察順鉑作用下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并拍照記錄。利用用衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色方法檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。利用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法檢測(cè)衰老細(xì)胞內(nèi)NMYC及p-NMYC蛋白水平的表達(dá)情況。利用RT-PCR及Western Blot等技術(shù)研究與衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated sectroy phenotype,SASP)現(xiàn)象密切相關(guān)的IL-6/STAT3信號(hào)通路。結(jié)果:1、MTT結(jié)果提示不同濃度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和5μmol/L)順鉑處理IMR32細(xì)胞后,24 h以?xún)?nèi)各組細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯差異。濃度為5μmol/L組在作用48 h后細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制,72 h時(shí)表現(xiàn)更為明顯;2μmol/L組在48 h后細(xì)胞增殖速度明顯減緩,與0.5μmol/L組和1μmol/L組比較有顯著差異,72 h出現(xiàn)明顯增殖抑制;0.5μmol/L組對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響。2、流式細(xì)胞分析顯示不同濃度(0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L和5μmol/L)順鉑處理IMR32細(xì)胞48 h后,細(xì)胞周期在G2/M期的細(xì)胞分別占30.95%、57.58%、70.14%和38.69%,與對(duì)照組(G2/M期細(xì)胞占10.76%)比較有明顯差異。其中以濃度為2μmol/L組G2/M期阻滯率最高,占70.14%,同時(shí)凋亡檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡不明顯。而濃度為5μmol/L組阻滯率為38.69%,凋亡檢測(cè)顯示凋亡細(xì)胞明顯增多。3、小劑量順鉑(2μmol/L)作用于細(xì)胞24 h時(shí),鏡下觀細(xì)胞形態(tài)改變不明顯,而作用48 h之后,顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞體積明顯增大,沒(méi)有明顯細(xì)胞死亡。SA-β-gal衰老細(xì)胞染色可見(jiàn)給藥組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組,說(shuō)明小劑量順鉑在一定作用時(shí)間內(nèi)能夠誘導(dǎo)IMR32細(xì)胞出現(xiàn)衰老。4、收集順鉑(2μmol/L)作用不同時(shí)間段的細(xì)胞進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示藥物作用6 h和24 h時(shí),與對(duì)照組相比,加藥組細(xì)胞內(nèi)NMYC及p-NMYC蛋白無(wú)明顯變化,隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng),在作用48 h以后NMYC及p-NMYC蛋白呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。5、與SASP相關(guān)的最突出的細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6),PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與對(duì)照組相比,在藥物作用24 h后細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平有所升高。結(jié)論:1、不同濃度順鉑可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖,其中小劑量順鉑主要通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,而大劑量順鉑主要通過(guò)引起細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。2、小劑量順鉑可誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞出現(xiàn)衰老,進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng),而且NMYC蛋白在衰老的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),伴有IL-6 mRNA表達(dá)水平的升高。
【圖文】：

MR32 細(xì)胞增殖的影響 方法初步檢測(cè)不同濃度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmo不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、6 h、24 h、48 h 和 72 h）IMR32 細(xì)同濃度的順鉑作用于 IMR32 細(xì)胞 24 h 以?xún)?nèi)細(xì)胞活力，不同濃度處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)逐漸出現(xiàn)差異，以 5藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞增殖活力明顯受到抑制 細(xì)胞的增殖活力也具有抑制作用，其中作用 48 h 的 2 減緩，而且與 1 μmol/L 和 0.5 μmol/L 順鉑作用有顯著.01873），72 h 出現(xiàn)明顯增殖抑制作用。濃度為 0.5 μm，見(jiàn)圖 1。由此可見(jiàn)，順鉑濃度為 2 μmol/L 以上時(shí)，的增殖有明顯的抑制作用。

亡不明顯的情況下，對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的周期阻滯作用，而5 μmol/L組抑制細(xì)胞增殖的原因可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。圖2.A 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期； B 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡2.4.3 順鉑誘導(dǎo)IMR32細(xì)胞衰老的作用研究處于衰老狀態(tài)的細(xì)胞通常表現(xiàn)為細(xì)胞的體積變大呈現(xiàn)扁平狀態(tài)、細(xì)胞核膜內(nèi)陷、細(xì)胞器變形，并且表達(dá)在 PH 6.0 時(shí)有高酶活性的 β-半乳糖苷酶，催化底物 X-Gal 生成深藍(lán)色沉積產(chǎn)物[26]。為了檢測(cè)順鉑對(duì) IMR32 細(xì)胞的衰老誘導(dǎo)效應(yīng)，，本研究根據(jù) MTT及流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了 2 μmol/L 為順鉑進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的作用濃度，利用 2μmol/L 的順鉑處理 IMR32 細(xì)胞，觀察順鉑作用不同時(shí)間后細(xì)胞形態(tài)的改變，并且選擇作用 48 h 之后進(jìn)行細(xì)胞衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）試劑盒染色，觀察細(xì)胞衰老情況。藥物處理細(xì)胞后置于顯微鏡下觀察，并于 40 倍鏡頭下與對(duì)照組相比
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2607224