【摘要】：膠質瘤(glioma)屬于高度惡性腦腫瘤,其高發(fā)病率、高復發(fā)率、高病死率和低治愈率等特點使其成為困擾臨床醫(yī)生的難題。目前,膠質瘤的發(fā)病機制尚不清楚,臨床上仍缺乏安全有效的治療方法。近年來有研究發(fā)現(xiàn)大腦可以通過腦膜淋巴管與外周免疫系統(tǒng)連接。這一發(fā)現(xiàn)讓學術界重新認識大腦免疫微環(huán)境與神經系統(tǒng)疾病的關系。腫瘤免疫治療也為臨床工作人員提供了膠質瘤治療新手段。目前免疫治療包括免疫檢查點治療、過繼免疫治療、腫瘤疫苗治療等。其在黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中抗癌效應良好。但免疫治療在膠質瘤中尚處于初步階段。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤細胞在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)的影響下行使其功能。TME是一個由腫瘤細胞、細胞外基質、免疫細胞等共同構成的腫瘤局部的病理環(huán)境。膠質瘤其獨特的TME能影響膠質瘤侵襲性,相關研究成為近年來的熱點,逐漸受到研究者們的重視。膠質瘤TME中除了腫瘤細胞還包括非腫瘤細胞,例如腫瘤相關成纖維細胞、血管內皮細胞以及瘤體中的免疫細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等)。其中腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAMs)作為一類重要的炎癥細胞可通過分泌釋放多種細胞因子和趨化因子,調節(jié)腫瘤侵襲能力,在腫瘤細胞的增殖、浸潤和腫瘤血管的生成中發(fā)揮重要的作用。有文獻報道TAMs與惡性腫瘤血管生成、轉移及患者預后有密切關系,可作為惡性腫瘤患者預后的一種獨立評價指標。膠質瘤TME中的TAMs(主要包括原位定植于腦部的小膠質細胞及血腦屏障破壞后浸潤的骨髓來源的巨噬細胞)作為一線的免疫細胞具有極大的可塑性,既可在膠質TME中受膠質瘤分泌細胞因子的調控而促進腫瘤的生長及侵襲,也可以在特定環(huán)境下成為殺傷腫瘤的一員。而在以往對巨噬細胞在先天性免疫疾病及炎癥反應中研究較多,但是其在腫瘤中所扮演的角色尚需探索。從芍藥干燥根中提取的白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)其主要成分(40%)是芍藥苷(paeoniflorin,Pae)。為提高芍藥苷的生物利用度,我所對其結構改造,合成了芍藥苷-6-O-苯磺酸酯(paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CP-25可抑制肝癌細胞的增殖并且CP-25對巨噬細胞表現(xiàn)出了免疫調控的作用,這提示CP-25有可能通過免疫調控TME中TAMs從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們組的前期研究結果也證實CP-25的確能通過影響了TAMs間接降低了膠質瘤細胞的增殖及遷移能力。所以我們推測CP-25的抑癌機制可能與調節(jié)膠質瘤TME中的TAMs有關。但具體通過何種機制發(fā)揮這種調節(jié)作用,目前仍不明確。因此CP-25如何通過調節(jié)TAMs影響膠質瘤微環(huán)境從而發(fā)揮抑制膠質瘤細胞生長的作用,是本文的研究重點。目的:揭示CP-25能否通過調控免疫調控TAMs從而抑制膠質瘤的發(fā)展,并進一步闡明CP-25調節(jié)膠質瘤TAMs中影響膠質瘤的生長微環(huán)境的具體分子機制,為膠質瘤的治療及發(fā)病機制研究提供實驗依據。方法:共收集45例人的膠質瘤及癌旁組織標本,檢測膠質瘤組織中巨噬細胞的浸潤、新生血管生成及炎癥發(fā)生情況。從病人膠質瘤組織中分離原代TAMs和原代腫瘤細胞,結合人源膠質瘤細胞系T98G和小鼠膠質瘤細胞系GL261,在體外建立原代TAMs和三種膠質瘤細胞共培養(yǎng)體系。利用CCK-8和Transwell實驗研究CP-25能否通過作用于原代TAMs間接抑制三種腫瘤細胞的增殖和遷移。體內實驗部分共構建三種腫瘤模型:a.GL261細胞注射裸鼠背部皮下構建異位植瘤模型;b.人源原代腫瘤細胞注射到裸鼠腦部構建原位PDX模型;c.將CX3CR1-GFP小鼠骨髓細胞移植到輻射后WT小鼠中建立骨髓嵌合體模型,再將GL261細胞注射到裸鼠腦部構建腦部原位腫瘤模型。利用這三個腫瘤模型在體內研究CP-25通過影響TAMs從而影響膠質瘤生長的抑制作用。計算小鼠腫瘤模型的生存周期;對腫瘤模型中形成的瘤體HE染色;qPCR、western blot免疫組化法檢測瘤體中血管生成相關因子CD31、VEGF、α-SMA,炎癥相關因子TNF-α、IL-1、IL-6和骨髓來源的巨噬細胞標志物Ly6C、CD11b的表達。對于骨髓嵌合體小鼠的腫瘤模型,利用流式細胞術研究CP-25對瘤體中原位的TAMs和骨髓來源的TAMs的作用。為了研究CP-25是否影響TAMs介導的血管生成,我們利用CP-25處理后的TAMs培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細胞,利用CCK-8、Transwell和Tube formation實驗研究CP-25通過作用于TAMs抑制了HUVEC的增殖、遷移和成管能力。Western blot檢測AKT通路關鍵蛋白(PI3K、AKT、p-AKT、TSC2、mTOR)在臨床膠質瘤組織中和原代TAMs中的表達。利用qPCR、流式細胞術和ELISA檢測CP-25和AKT通路抑制劑LY294002體外作用于原代的TAMs,對其AKT通路關鍵蛋白(PI3K、AKT、p-AKT),血管生成相關因子(VEGF、MMP2、MMP9)的作用。LY294002處理后TAMs的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)原代腫瘤細胞和HUVEC,利用CCK-8,Transwell和Tube formation檢測AKT通路抑制TAMs對原代腫瘤細胞的增殖和遷移及HUVEC增殖、遷移和成管的影響。結果:1.膠質瘤患者的腫瘤組織血管生成及TAMs浸潤情況。我們收集了45例膠質瘤患者膠質瘤及癌旁組織。PCNA染色顯示腫瘤組織中惡性增殖的細胞明顯高于癌旁組織;HE染色結果顯示膠質瘤的平均血管計數(shù)明顯高于相鄰的癌旁組織,并且血管生成標志物CD31、VEGF和α-SMA的表達高于癌旁組織;人腦膠質瘤組織中TAMs浸潤明顯高于癌旁組織;一系列炎癥和血管生成相關基因的表達在膠質瘤組織中的表達也顯著高于癌旁組織。2.CP-25通過調節(jié)原代TAMs對膠質瘤細胞功能的影響。從膠質瘤組織中分離原代TAMs和原代腫瘤細胞,結合人源膠質瘤細胞系T98G和小鼠膠質瘤細胞系GL261,在體外建立原代TAMs和三種膠質瘤細胞共培養(yǎng)體系。CCK-8和Transwell實驗證實CP-25(10~(-4)~10~(-6)M作用6天)能通過作用于原代TAMs間接抑制三種腫瘤細胞的增殖和遷移能力。3.CP-25在小鼠異位膠質瘤模型和PDX膠質瘤模型中的作用。GL261細胞注射裸鼠背部皮下構建異位植瘤模型,CP-25(50mg/kg灌胃3周)能顯著抑制GL261細胞在體內形成瘤體的生長速度和瘤體內的新生血管生成。CP-25能明顯降低新生瘤體中血管生成標志物CD31、VEGF、FLT1、MMP2、MMP9、HIF1A、α-SMA和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達。人源原代腫瘤細胞注射到裸鼠腦部構建原位PDX模型,CP-25(50mg/kg灌胃4~5周)能顯著提高荷瘤小鼠的生存周期。CP-25也能明顯降低新生瘤體中血管生成標志物CD31、VEGF、α-SMA和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達。此外CP-25還能誘導新生瘤體中缺氧相關因子的表達。4.CP-25對TAMs介導的血管生成的影響。CP-25(50mg/kg灌胃4~5周)能顯著抑制新生瘤體中TAMs的浸潤。并且CP-25能抑制原代TAMs中血管生成相關因子MMP2、MMP9、VEGFA的表達,促進TAMs的吞噬能力。利用CP-25(10~(-5)M作用6天)處理后的TAMs培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細胞,利用CCK-8、Transwell和Tube formation實驗證實CP-25通過作用于TAMs抑制了HUVEC的增殖、遷移和成管能力。5.CP-25對骨髓來源TAMs在膠質瘤中浸潤的影響。先將CX3CR1-GFP小鼠的骨髓細胞移植到輻射后的WT小鼠中制備嵌合體模型,后向嵌合體小鼠腦部注射GL261細胞建立膠質瘤模型。流式細胞術結果顯示嵌合體小鼠骨髓來源的TAMs細胞(CD45~(hi)CD11b~(hi))幾乎全部來自CX3CR1-GFP小鼠的骨髓細胞。經CP-25(50mg/kg灌胃3~4周)處理后,骨髓來源TAMs的在腫瘤中的浸潤明顯受到抑制。而腫瘤原位定植的小膠質細胞(CD45~(int)CD11b~(hi)),經CP-25處理后大部分保留在腫瘤內,顯示CP-25特異性抑制了骨髓來源TAMs向腫瘤組織的浸潤。此外,嵌合體模型的腫瘤組織免疫組化PCNA染色和流式細胞術檢測Ki-67結果顯示,CP-25能抑制骨髓嵌合體小鼠腦部的腫瘤生長。6.CP-25對TAMs中PI3K-AKT信號通路的作用與癌旁組織相比,Western blot及IHC結果顯示膠質瘤中PI3K-AKT信號通路通路活性上調。流式細胞術結果顯示,在分離的TAMs中,PI3K-AKT通路關鍵蛋白表達也明顯增加。流式細胞術結果提示CP-25(10~(-5)M作用24~48h)和LY294002(10μM作用24~48h)均可抑制原代TAMs中PI3K-AKT通路中關鍵蛋白的表達水平。RT-qPCR顯示抑制原代TAMs中PI3K-AKT通路可下調血管新生標志物mRNA水平,ELISA結果顯示抑制原代TAMs中PI3K-AKT通路可下調VEGF分泌。CCK-8增殖實驗及Transwell遷移實驗結果顯示LY294002處理后TAMs條件培養(yǎng)基可抑制膠質瘤細胞的體外增殖和遷移;及抑制HUVEC增殖、遷移和成管。結論:1.和癌旁正常組織相比,臨床膠質瘤患者的膠質瘤組織中新生血管生成及TAMs浸潤明顯增多。2.CP-25在體外水平通過調節(jié)原代TAMs間接抑制膠質瘤細胞的增殖與遷移能力。3.CP-25在體內水平顯著小鼠異位腫瘤模型和腦部原位PDX模型的腫瘤生長,延長荷瘤小鼠的生存周期。并且CP-25能明顯下調瘤體中新生血管生成和TAMs的浸潤。4.CP-25能抑制TAMs介導的HUVEC的增殖,遷移和成管能力。5.利用骨髓嵌合體小鼠腫瘤模型證實CP-25特異性抑制骨髓來源TAMs在膠質瘤中的浸潤。6.CP-25通過抑制TAMs中PI3K-AKT信號通路改善膠質瘤細胞的腫瘤微環(huán)境。
【圖文】：

1. CP-25 合成示意圖 CP-25 是我所對白芍總苷(TGP) 中主要有效活性單體成分芍藥苷Pae) 結構進行酯化修飾而合成的新型具有抗炎免疫作用的活性單體藥物。ig 1. Synthesis diagram of CP-25 CP-25 is a new type of active monomer drug withnti-inflammatory and immune effects synthesized by esterification of Pae, the main activeonomer in TGP.

5 合成示意圖 CP-25 是我所對白芍總苷(TGP) 中主要有效活性單體成進行酯化修飾而合成的新型具有抗炎免疫作用的活性單體藥物。thesis diagram of CP-25 CP-25 is a new type of active monomer matory and immune effects synthesized by esterification of Pae, the m TGP.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4

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本文編號：2601779