【摘要】：目的:1、比較mi RNA-210在急性腦梗死(ACI)患者及健康人群血清中的表達差異;2、評估血清中mi RNA-210表達水平在ACI患者的診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用以及與患者血清中炎癥因子水平的相關(guān)性;3、探討ACI患者血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)mi RNA-210表達的影響;4、研究mi RNA-210對HUVECs細胞增殖與凋亡的影響;5、研究mi RNA-210對HUVECs細胞中Hes1、Notch1、VEGF在m RNA和蛋白水平表達的調(diào)控;6,建立大鼠大腦中腦動脈閉塞(MCAO)模型,研究mi RNA-210在MCAO模型大鼠血清和腦組織中的表達水平及其相關(guān)性;7、檢測MCAO大鼠模型血清和腦組織中Hes1、Notch1、VEGF在m RNA水平的表達,以及腦組織中Hes1、Notch1、VEGF在蛋白水平表達情況,研究mi RNA-210表達對大鼠急性腦梗死的調(diào)控機制。方法:1,選取2016年1月至2016年12月泰州市人民醫(yī)院急診科接診的ACI患者70例,同時納入40例正常體檢者作為健康對照組。采用熒光實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-q PCR)法檢測ACI患者和健康對照組血清中mi RNA-210表達水平并進行統(tǒng)計學(xué)分析。建立受試者工作曲線(ROC)評估血清mi RNA-210表達水平對ACI的診斷價值。2、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法分別檢測血清炎癥因子C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細胞介素-6(IL-6)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)及降鈣素原(PCT)水平。計算患者入院后美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分。研究患者血清中mi RNA-210表達與炎癥因子水平及NIHSS評分的相關(guān)性。3、ACI患者發(fā)病后第30天參照格拉斯哥預(yù)后評分(GOS)標準進行預(yù)后分析,系統(tǒng)評價mi RNA-210以及炎癥因子在評估ACI疾病預(yù)后中的價值。4、收集ACI患者及健康人血清,通過RT-q PCR法檢測比較患者血清培養(yǎng)組、健康人血清培養(yǎng)組和空白對照組三組HUVECs細胞中mi RNA-210含量,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。5、應(yīng)用CCK8細胞增殖實驗和Annexin V-PI雙染法及流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染mi RNA-210模擬物組(mi RNA-210組)、轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照組(NC組)和未轉(zhuǎn)染組(Control組)三組HUVECs細胞增殖和凋亡情況,評價mi RNA-210對HUVECs細胞增殖和凋亡的影響。6、通過RT-q PCR、Western blot方法檢測mi RNA-210組、NC組和Control組HUVECs中Hes1,Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表達,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。7、選取健康SD大鼠22只,隨機分為MCAO模型組12只和正常對照組10只,采取線栓法構(gòu)建大鼠MCAO模型并進行神經(jīng)系統(tǒng)功能評分。其中1只MCAO大鼠行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察腦組織梗死情況,取另1只MCAO大鼠進行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色,顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞形態(tài)變化情況。8、采用RT-q PCR法分別檢測MCAO模型大鼠和正常對照組大鼠各10只血清和腦組織中mi RNA-210表達水平,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。9、應(yīng)用RT-q PCR和Western blot法檢測MCAO模型大鼠和正常對照組大鼠血清中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA水平的表達和腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA及蛋白水平的表達,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1,ACI患者血清中mi RNA-210水平與健康對照組相比明顯上調(diào)(P0.05)。ROC曲線分析結(jié)果顯示,mi RNA-210的曲線下面積(AUC)為0.942,95%置信區(qū)間(CI)為0.898~0.986,最優(yōu)割點為1.6,而切點的敏感性和特異性分別為82.86%和97.50%。2,ACI患者血清中mi RNA-210水平與GOS預(yù)后評分成正相關(guān),和NIHSS評分成負相關(guān);與健康對照組相比,ACI患者血清CRP、IL6及NGAL水平升高(P0.05),但與GOS預(yù)后評分和NIHSS評分無相關(guān)性。3,ACI患者血清培養(yǎng)HUVECs后,與健康人血清培養(yǎng)組和空白對照組相比,HUVECs中mi RNA-210表達顯著上調(diào)(P0.01)。4,CCK8細胞增殖實驗中,mi RNA-210組較NC組和Control組,培養(yǎng)48h后HUVECs的細胞增殖率上升(P0.05),培養(yǎng)72h后HUVECs的細胞增殖率顯著上升(P0.01)。培養(yǎng)48h后,對細胞進行Annexin V-PI雙染,流式細胞儀分析顯示:mi RNA-210組較NC組及Control組,HUVECs細胞凋亡率顯著下降(P0.01)。5,應(yīng)用RT-q PCR、Western blot方法檢測mi RNA-210組HUVECs細胞中Hes1,Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平表達結(jié)果顯示:mi RNA-210組中Hes1和VEGF在m RNA水平表達增加,與另外兩組對比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),而Notch1表達與另外兩組相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);Hes1,Notch1和VEGF蛋白水平表達mi RNA-210組與其余兩組比較均顯著上調(diào),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。6,TTC染色后可見MCAO大鼠模型中腦組織梗死側(cè)中明顯梗死病灶。HE染色后顯微鏡下可見MCAO模型梗死病灶組織中大量神經(jīng)細胞核濃縮凋亡,而健側(cè)腦組織見少許凋亡細胞。7,應(yīng)用RT-q PCR法檢測MCAO大鼠模型血清和腦組織中mi RNA-210表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO模型大鼠腦組織及血清組織中mi RNA-210表達水平較正常對照組明顯上調(diào),且血清和腦組織中mi RNA-210的表達具有相關(guān)性,具有統(tǒng)計學(xué)差異。8,應(yīng)用RT-q PCR、Western blot方法檢測MCAO大鼠模型血清和腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠模型血清及腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA水平較正常對照組大鼠均上調(diào);腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在蛋白水平較正常對照組大鼠亦上調(diào)。均具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:1,在ACI患者中,血清mi RNA-210有潛力成為ACI診斷和預(yù)后預(yù)測的生物學(xué)標志物;炎癥因子CRP、IL-6、NGAL水平在ACI早期升高,但與ACI患者神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度和預(yù)后不相關(guān)。2,ACI患者血清環(huán)境能夠提高HUVECs細胞中mi RNA-210的表達;通過細胞實驗研究發(fā)現(xiàn):mi RNA-210在ACI中的調(diào)控機制可能與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡以及上調(diào)Hes1、VEGF在m RNA表達和上調(diào)Hes1、Notch1和VEGF在蛋白水平的表達相關(guān);3,成功構(gòu)建大鼠MCAO模型,MCAO大鼠血清和腦組織中mi RNA-210的表達水平均升高,在動物模型中再次驗證mi RNA-210可能通過上調(diào)Hes1、Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表達,從而參與ACI的調(diào)控機制。
【圖文】：

給予碘伏消毒后，取頸部正中切口，逐層切開用彎頭止血鉗鈍性分離周圍組織及腺體，充分分離，觸及動脈搏動后，逐步分離右側(cè)頸動脈分離，辨別頸動脈鞘內(nèi)右側(cè)頸總動脈(CCA)脈(ICA)等解剖結(jié)構(gòu)。小心剝開并輕輕提起頸。同樣分離剝開并用細線將右側(cè)頸總動脈提起動脈夾將頸總動脈阻斷后，將右側(cè)頸總動脈在夾。在頸外動脈壁剪一斜角切口，插入準備好外動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈到達大腦中動脈開口處，線當回縮后調(diào)整角度再行插入，線栓插入深度大栓栓塞完成后，一起結(jié)扎右側(cè)頸外動脈和線栓進一步清創(chuàng)，縫合切口。待大鼠清醒。術(shù)畢

-210 在急性腦梗死中的作用及其相關(guān)機制研究 期的 HUVECs 細胞，，提取各組總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后， HUVECs 細胞中的 miRNA-210 表達水平進行檢測。結(jié)果顯示UVECs 細胞中 miRNA-210 表達水平顯著增高，與健康人血清比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），見圖 10�？梢娂毙阅X梗死患iRNA-210 的表達。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

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本文編號：2587989