【摘要】：研究背景： 膠質母細胞瘤(GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最致命的疾病之一,大多數(shù)GBM患者的生存期是12個月。目前針對GBM的治療方法有手術、化療和放療等。然而,多數(shù)GBM患者的生存時間只增加了3個月。影響其徹底治愈的因素有腫瘤的手術后復發(fā),腫瘤對周圍正常組織的浸潤,以及固有或獲得性放化療耐藥性的產生。 雖然針對DNA-甲基化的藥物制劑替莫唑胺(TMZ)已經(jīng)用于神經(jīng)膠質瘤的治療,多個生長因子受體如PDGFR、表皮生長因子受體已經(jīng)作為治療靶點。在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞中加入PDGFR/c-KIT abl激酶抑制劑顯著降低了細胞的活性和非貼壁生長的趨勢。但臨床上只有10-20%的患者對這些抑制劑產生治療效果。由于耐藥性的產生,大多數(shù)病人隨后表現(xiàn)出腫瘤快速生長。威爾遜等人發(fā)現(xiàn)RTK配體的抑制劑可以逆轉腫瘤的固有耐藥和獲得性耐藥。然而其具體的作用機制尚未完全闡明。 伊馬替尼是最具代表性的RTK抑制劑。在體內外的神經(jīng)膠質瘤模型中已經(jīng)證實伊馬替尼可抑制腫瘤生長。我們前期試驗中構建了耐伊馬替尼的GBM細胞株U251AR,通過二維差異凝膠電泳法(2D-DIGE)和蛋白質質譜分析法研究與GBM化療耐藥性相關的蛋白質。蛋白質組學在研究蛋白質特性方面有著極為重要的作用。2D-DIGE對蛋白分離和量化相當敏感。蛋白質通過與不同的熒光染料標記后混合,通過凝膠分離。蛋白質組學方法為我們探索腫瘤的多藥耐藥、尋找腫瘤生物標志物和治療靶點方面提供新的機遇。 聚合酶Ⅰ和轉錄釋放因子(PTRF),最早稱為cavinl,在體外培養(yǎng)細胞中參與蛋白質轉錄復合物的解離。PTRF存在于細胞膜表面,與胞膜小泡轉運,膽固醇平衡和脂類分解的調控有關。PTRF突變與人類先天性全身性脂肪代謝障礙有關�；蛳嗷プ饔醚芯勘砻�,PTRF除有上述功能外,還可能有其他功能。在前列腺癌和肺癌中,PTRF表達的缺失被認為與腫瘤增殖有關。PTRF的胞質微囊結構蛋白和caveolinl在乳腺癌的化療多藥耐藥中有著至關重要的作用。PTRF可誘發(fā)多種體外培養(yǎng)細胞及斑馬魚胚胎細胞中形成豐富的胞質微囊。PTRF和caveolinl在細胞質微囊中有著密切聯(lián)系。已有報道表明caveolin蛋白位于胞質微囊,其對微囊本身有著至關重要的作用。Quann和他的同事發(fā)現(xiàn),在膠質母細胞瘤細胞株U87中過表達caveolinl可抑制細胞生長和生存。與正常腦組織中的星形細胞相比,caveolinl在膠質母細胞瘤細胞中的表達量明顯增多。在人類膠質母細胞瘤體內外模型中,瘤細胞耐受TMZ后影響了caveolinl的表達。然而,PTRF在膠質母細胞瘤中的相關研究卻很少。因此,在本實驗中,我們研究PTRF在膠質母細胞瘤細胞株及臨床標本中的表達和相關功能。并分析PTRF在膠質母細胞瘤細胞耐藥性中的作用。我們的數(shù)據(jù)表明PTRF可成為膠質母細胞瘤患者治療的新靶點,對膠質瘤的治療可能具有重大意義。目的： 本研究通過構建膠質母細胞瘤細胞系U251的化療耐藥細胞株U251AR,并通過熒光標記的雙向電泳技術及蛋白質譜技術測定U251及U251AR差異表達的蛋白；通過western blot及QRT-PCR驗證差異表達蛋白PTRF在各細胞株中的表達。并構建干擾質粒敲除PTRF在U251及U251AR中的表達,MTT及細胞耐藥性進一步證實PTRF在膠質母細胞瘤化療耐藥性中的作用。同時,我們研究PTRF的協(xié)同蛋白caveolinl在U251AR細胞系中表達。最后,我們免疫組化及QRT-PCR技術在原發(fā)性膠質母細胞瘤及常規(guī)化療后復發(fā)的膠質母細胞瘤患者的組織標本中的表達,我們通過相關性分析PTRF及caveolin1在所有膠質母細胞瘤患者中的相關情況。 實驗方法： 1、組織標本的收集 病人標本收集于珠江醫(yī)院和南方醫(yī)院(南方醫(yī)科大學、廣州、中國)。研究對象包括Ⅰ級星形細胞瘤8例,Ⅱ級星形細胞瘤13例,Ⅲ級星形細胞瘤10例,膠質母細胞瘤27例。在27個膠質母細胞瘤表本中,6例在接受TMZ治療6個月后復發(fā)。在標本收集之前,根據(jù)南方醫(yī)科大學倫理學機構的指導方針,所有患者給予書面告知并取得知情同意。在手術室手術切除組織樣本后立即快速冰凍。腫瘤及非腫瘤組織由神經(jīng)病理學教授診斷鑒定。正常組織鑒定標準為：根據(jù)病檢證實未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞。對于每一個病人,留取腫瘤組織樣本(存儲在-80攝氏度冰箱)和石蠟包埋組織標本。 2、細胞培養(yǎng)及耐藥細胞株的構建 人類GBM細胞株U251由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院饋贈。多藥耐藥細胞株U251AR由本實驗室構建并培養(yǎng)。細胞株使用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)(含10%胎牛血清FBS,青霉素200U/毫升和鏈霉素100μg/毫升)。細胞在37℃,5%的二氧化碳,濕潤的培養(yǎng)箱中生長。通過對U251細胞株不斷增加伊馬替尼(STI571)的濃度,本實驗室成功構建具有伊馬替尼耐藥的細胞系U251AR.為保持U251AR細胞多藥耐藥性,在U251AR細胞的培養(yǎng)基中添加伊馬替尼(濃度122μg/毫升)。 3、細胞免疫熒光 調整細胞密度為3×105細胞/孔,置于Lab-Tek雙孔載玻片并孵育過夜.隔日,當細胞鋪滿50-70%,PBS清洗兩次后用4%多聚甲醛固定和0.1％Tritonx-100,4攝氏度下滲透30分鐘。然后PBS清洗細胞3次并用封閉液孵育。成功后加入PTRF或caveolinl一抗,4攝氏度下過夜。之后PBS清洗3次,加入二次抗體山羊抗兔Alexa Fluor488(1:1,000)室溫下暗室靜置1h。最后,PBS清洗3次,加入0.25毫克／毫升DAPI室溫下暗室靜置1分鐘。PBS足量清洗,恒定曝光條件下,使用激光共聚焦掃描顯微鏡60倍下觀察。 4、U251及U251AR細胞的蛋白提取 從U251和U251AR細胞株細胞提取細胞裂解液。加入冰凍裂解緩沖液和裂解混合液,機械破壞細胞。樣本經(jīng)超聲處理(冰浴,每次10秒,30秒后重復6次)和離心(15000g,30分鐘,4攝氏度)。超速離心108000轉,60分鐘,4攝氏度下提取上清液。Bradford蛋白質分析法測定濃度和所提取蛋白質(100μg)在-80攝氏度保存。 5、蛋白的熒光標記 蛋白提取物按CyDyes DIGE Fluors (GE Healthcare, Bucks, UK)推薦說明書處理,使用CyDyesFluors熒光素標記。簡而言之,每50μg樣本的最少加入400pmol胺反應類花青染料(Cy3或Cy5)暗室中冰浴30分鐘。U251和U251AR都用Cy5或Cy3不同的凝膠標記。Cy2熒光染料標記內參照,將等量的U251和U251AR細胞共培養(yǎng)。黑暗中加入10mM賴氨酸,冰浴10分鐘后終止標記反應。標記反應物,U251和U251AR細胞提取物與內參照一起,加入DestreakTMIEF緩沖液達到450μl,放入5個24厘米長的凝膠片。 6、熒光雙向電泳的制備及蛋白電泳分析 使用IPGphorTM系統(tǒng)完成等電點電泳。預先固定pH梯度膠(pH值3-10,24厘米),用于單向分離。IEF之后,IPG條帶環(huán)境溫度下在含有65mM DTT和250mM碘乙酰胺的平衡溶液中孵2次,各15分鐘。條被直接置于預制的12%sds-page凝膠頂部并在Ettan DaltSix系統(tǒng)垂直電泳約5小時。另一個凝膠跑帶以同樣的方式選擇蛋白質。 7、2D-DIGE凝膠成像及數(shù)據(jù)分析 在凝膠電泳后,cyanine標記的蛋白質在TyphoonTM9400成像儀熒光模式下直接可視。Cy2, Cy3, Cy5圖像分別用488nm,532nm和633nm激光掃描所得。每個凝膠在200μm分辨率(像素大小)下掃描,使用DeCyder處理軟件V5.01對其進行量化、凝膠匹配和統(tǒng)計分析。為消除圖像的人為影響和圖像中蛋白質斑點的差異量化使用DIA對每個凝膠的兩個樣品在(U251和U251AR)予以配對比較。使用BVA,同時對比凝膠匹配圖中所有的蛋白斑點。使用S檢驗(p0.05)進行統(tǒng)計分析。標準化后,蛋白質斑點至少在1.5倍以上的體積的變化被認為調控差異。統(tǒng)計分析計算結果與Engelen K. et al報道的結果基本相似。雙凝膠匹配的斑點以的標準偏差log10條件下計算分析。計算每個條件下標準差的中位數(shù)。2D-DIGE成像和分析后,考馬斯蘭染制備凝膠。凝膠進行掃和存儲在1%醋酸,4攝氏度下完成,直到斑點消失。手動匹配考馬斯蘭凝膠與熒光地圖,使用Image MasterTM2d軟件選擇分析。 8、質譜鑒定 考馬斯藍染色的蛋白質斑點從雙向凝膠中切除并用EttanTM斑點處理工作站軟件處理。膠填充物用MilliQ水洗3次,然后用50%甲醇/50mM碳酸氫銨和75%ACN沖洗,確保完全去除染料和洗滌劑。干燥后,凝膠塊在20毫NH4HCO3和16.6μg/毫升豬胰蛋白酶再次水化60分鐘。分別連續(xù)添加50%的ACN和50%的TFA完成提取。消化產物脫水后,在斑點到達MALDI靶點之前,溶解在含2毫克/毫升a-cyano-4-hydroxycinnamic酸的70%ACN/0.1%TFA中。MALDI-TOF/TOF質譜計獲得肽團塊印記,使用FlexAnalysisTM軟件生成峰值列表并用胰蛋白酶的自動消化肽段做內參。峰列表然后轉移至ProteinScapeTM軟件,以包含自我分解的峰值和污染物為基礎,做為另一個自動校準列表(與樣本有類型和治療有關)。再次校準后,自動胰蛋白酶和燃料進行了過濾和刪除,得到m/z比率和高鑒別率(Score-Booster)。只有單一同位素的胰蛋白酶肽團塊被用于使用Mascot search algorithm NCBI數(shù)據(jù)庫序列檢索。搜索條件如下：初始窗口以70ppm為內參標準,接受只錯過一個斷裂的團塊,以碘乙酰胺和甲硫氨酸氧化變量調整半胱氨酸。使用probability-based Mowse獲取結果評分(蛋白質數(shù)是-10×log(P))。P是一個隨機事件發(fā)生的概率。在我們的實驗中,得分大于90具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 9、Western bolt 胞質蛋白提取液(10～30μg)加入12%聚丙烯酰胺凝膠進行單通道電泳。使用生物素化ECL western blotting作為分子量標記。蛋白質被轉移至PVDF膜,U251, U251AR和其他細胞中提取等量蛋白,由Bradford蛋白質定量試劑盒計算單位體積的蛋白含量,在每個凝膠中加入等量的蛋白后進行量化分析。非特異性位點被含5%(w/v)脫脂奶粉的Tris-buffered鹽水(TBS)封閉。斑點加入一抗后,在含有0.1%Tween20和1%脫脂奶粉的TBS中孵育。一抗主要包括：兔抗人單克隆抗體PTRF(稀釋比例1：1000),兔抗人單克隆抗體caveolinl (稀釋比例1：1500),兔抗人單克隆抗體VIM(稀釋比例1：1000)和山羊抗人單克隆抗體P-gp(稀釋比例1：150),P-actin作為內參。TBS沖洗后,印記在過氧化物結合的IgG二抗1：5000和Streptavidin-HRP(生物素化的標記)中孵育,增強化學發(fā)光體系ECL用于顏色顯影。 10、QRT-PCR 總RNA提取使用Trizol試劑盒完成,反轉錄使用的引物Script RT reagent Kit。熒光定量RT-PCR根據(jù)SYBR Green試劑盒說明書進行,依據(jù)MX7500序列檢測系統(tǒng)完成。引物在表1中列出。GAPDH作為內參。所有樣品都以內參為標準量化,倍數(shù)的計算通過相對量化得出(2△△CT)。 11、PTRF的干擾 BLOCK-iT Pol II miR RNAi表達載體用來誘導干擾PTRF。簡而言之,單鏈microRNA退火形成雙列,插入至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體(Invitrogen,USA)。針對PTRF的短發(fā)卡RNA(shRNA)被稱為shPTRF�？蛰d體為shNC。根據(jù)說明書,質粒LipofectamineTM2000轉染到U251AR和U251細胞。孵化后24小時,加入500ng/mL鹽酸殺稻瘟菌素。轉染后,定量RT-PC檢測PTRF的mRNA水平。隨后,分析多個低表達PTRF的mRNA,并通過Western blotting進一步分析PTRF蛋白含量。最后,選出有效敲除PTRF的細胞株作干擾組進行分析。細胞轉染空載體作為陰性對照。 12、體外耐藥性檢測 U251及U251AR細胞轉染shNC和shPTRF后置于96孔板中,密度為每孔2×103個細胞,終體積為100μL。加入100μg/毫升TMZ孵化后24小時、48小時、72小時、96小時和120小時后通過CCK8法分析細胞生存能力。耐藥性方面,細胞在轉染后24h,再次植入從96孔板,密度為1.5×104/孔,與伊馬替尼,VP-16或TMZ(50到200μg/毫升)共培養(yǎng)48h。 13、膠質瘤患者組織標本的免疫組化鑒定 組織中PTRF和caveolinl的表達水平,使用超靈敏S-P試劑盒,按試劑盒說明書完成。一抗PTRF兔單克隆抗體1：100稀釋,caveolinl兔單克隆抗體1：150稀釋。Poly peroxidase兔多聚過氧化物酶IgG作為二抗,切片由光學顯微鏡分析。陰性對照同樣用一抗檢測。免疫印跡部分由光學顯微鏡檢查,物鏡和目鏡10x40。免疫印記強度使用圖像處理軟件pro-Plus6.0處理。 14、統(tǒng)計學方法 所有實驗重復三次。結果均為均數(shù)±標準差(SD)。統(tǒng)計分析使用一個方差分析(方差分析)或t檢驗。同一GBM標本中PTRF和Caveolin-1mRNA水平之間的關系使用Pearson相關性檢驗。當P值小于0.05被認為是具有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0軟件完成。 實驗結果： 1、通過持續(xù)的伊馬替尼刺激U251細胞,我們構建了耐伊馬替尼的GBM細胞株U251AR,同時我們檢測到U251AR對VP-16和TMZ產生耐藥。為了維持U251AR的多藥耐藥性,我們在培養(yǎng)U251AR的培養(yǎng)液中加入伊馬替尼(122μg/毫升)。本研究發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株U251AR的一些耐藥基因表達與U251相比明顯高表達。我們通過免疫印跡檢測ATP-依賴性藥物外泵(P-gp)蛋白的表達,并用定量RT-PCR法對U251AR和U251細胞中和P-gp、MRP1和BCRP mRNA水平進行測定。耐藥細胞株U251AR中P-gp, MRP1和BCRP的表達增加(*,P0.05)。這些結果表明,耐伊馬替尼的GBM細胞株U251AR構建成功。 2、為獲得U251和U251AR細胞整體蛋白情況,我們使用三個雙向凝膠電泳檢測兩種細胞系中不同蛋白質的表達。對于每個凝膠,綜合后的圖像源于U251,U251AR和內參樣本。與Cy3和Cy5-標記圖像的代表DIGE凝膠如圖所示。使用DeCyder軟件在DIA工作區(qū)共發(fā)現(xiàn)2516-2735斑點。在BVA模塊中,U251AR與U251相比,按給定的標準的比率大于1.5或小于1.5(P值0.05),41個斑點差異表達,其中23個斑點衰減和18個斑點上調。由于部分蛋白由于表達水平低,導致考馬斯藍凝膠未能檢測到相應斑點。MALDI-TOF/TOF MS分析發(fā)現(xiàn),兩個細胞系中有21個蛋白質斑點表達量顯著改變。包括PTRF和VIM在內的21個差異表達蛋白質中,U251AR細胞株9個蛋白質上調,12個蛋白下調。 3、為了驗證蛋白質組學的結果,我們通過免疫印跡和定量RT-PCR檢鋇PTRF和VIM的表達。與之前的結果一樣,免疫印跡和定量RT-PCR結果證實PTRF和VIM在U251AR中表達量均高于U251細胞(*,p0.05)。為了檢鋇PTRF及caveolinl在兩種細胞株中的表達量及表達部位,我們采用細胞免疫熒光檢測U251AR和U251細胞中PTRF和caveolinl的定位及定量。PTRF在細胞核和細胞質中均有表達,U251AR細胞質中的熒光度大于U251。Caveolinl同樣在細胞膜和細胞質中同時表達,且在U251AR的熒光度大于U251,以上表明U251AR比U251細胞可能擁有更多細胞質膜微囊。 4、為進一步檢測PTRF在GBM細胞中耐藥性中的作用,我們通過pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA敲除U251和U251AR細胞系中PTRF的表達。干擾效果由Western blotting和定量RT-PCR證實(*,P0.05)。我們同時檢測了干擾組細胞的caveolin1和P-gp的mRNA水平,與我們的預期及文獻報道相同,干擾組細胞的caveolinl和P-gp的mRNA表達水平與U251及U251AR相比也降低。 PTRF和caveolinl細胞質微囊的兩個重要結構,均被證實與腫瘤化療耐藥有關。為了檢測PTRF對細胞活力的影響,我們對U251、U251AR及敲除PTRF的細胞系加入TMZ(100μg/毫升)(24小時、48小時、72小時、96小時、120小時)后對細胞活性進行分析。分析得出,在相同的TMZ濃度下,與U251、U251AR細胞相比,敲除PTRF后細胞生存能力明顯降低(*,P0.05) 為檢鋇PTRF在GBM化學藥物敏感性中的作用,U251細胞、U251AR細胞和轉染細胞中加入伊馬替尼,VP-16和TMZ三種藥物之后,通過CCK8檢測法測定其的IC50值。在加入伊馬替尼,VP-16, TMZ后,shPTRF轉染細胞株的IC50值較U251和U251AR細胞顯著下降了2.05-3.92倍(**,P0.01),表明PTRF的下調可增加GBM對化療藥物的敏感性。 5、為了研究PTRF在膠質母細胞瘤耐藥中的作用,我們通過免疫組化法檢測58例星形細胞瘤患者和6例復發(fā)患者GBM組織中PTRF的表達。此外,8例正常腦組織被用作對照樣本。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：PTRF在低級星形細胞瘤(Ⅰ和Ⅱ級)和正常腦組織標本中低表達,但在高級別星形細胞瘤(Ⅲ和Ⅳ級)中高度表達。我們還發(fā)現(xiàn),PTRF在TMZ化療6個月后復發(fā)的GBM患者中的表達水平高于未經(jīng)化療的患者。與PTRF一樣,caveolinl在復發(fā)GBM患者中的表達水平同樣增高。此外,GBM復發(fā)患者PTRF和caveolinl的mRNA水平明顯高于原發(fā)的GBM患者(*,P0.01)。由于PTRF和caveolinl在生物學特性及功能方面都是細胞質微囊的兩個基本組成部分,因此,我們對同一GBM標本的PTRF和caveolin1mRNA水平做相關分析。研究表明,PTRF mRNA水平與caveolinl mRNA水平在同一GBM標本中呈正相關(2-tailed Pearson相關,r=0.766,P0.01)。這些結果表明,在同一GBM標本中PTRF的表達水平可能與caveolinl的表達水平相關。 結論： 1、通過蛋白質組學研究方法,我們揭示了GBM的耐藥性相關的眾多因子。 2、在這些因子中,在GBM的耐藥性上PTRF可能扮演著重要角色。 3、我們發(fā)現(xiàn)GBM標本的PTRF表達上調并在GBM復發(fā)患者樣本中表達水平更高。 4, PTRF可能作為GBM的生物標志物利于早期診斷和預后分析,成為GBM的潛在治療靶點。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【共引文獻】

相關期刊論文 前6條

1 袁泉;柳滿然;曾宗躍;周旭春;;microRNA與胃癌耐藥的關系[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2013年17期

2 周晶;沈志祥;羅和生;;量子點免疫熒光組化技術檢測肝細胞癌中窖蛋白1的表達[J];臨床消化病雜志;2013年05期

3 史丹;劉艷;廉馨;鄒偉;;Cavins:胞膜窖相關蛋白新視野[J];生物工程學報;2013年11期

4 Xin Zhou;Chun Yang;Yufeng Liu;Peng Li;Huiying Yang;Jingxing Dai;Rongmei Qu;Lin Yuan;;Lipid rafts participate in aberrant degradative autophagic-lysosomal pathway of amyloid-beta peptide in Alzheimer's disease[J];Neural Regeneration Research;2014年01期

5 謝琴;高召兵;;離子通道與腫瘤相關性的研究進展[J];生命科學;2014年10期

6 Rajamma Mathew;;Pulmonary hypertension and metabolic syndrome: Possible connection, PPARγ and Caveolin-1[J];World Journal of Cardiology;2014年08期

相關博士學位論文 前3條

1 張又枝;NF-κB和PPAR-γ交叉對話調控LDL穿胞及其在動脈粥樣硬化中的作用[D];華中科技大學;2013年

2 李飛;篩選膀胱癌尿液新標記物Gc-globulin的熒光差異蛋白質組學研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

3 張又枝;NF-κB和PPAR-γ交叉對話調控LDL穿胞及其在動脈粥樣硬化中的作用[D];華中科技大學;2013年

相關碩士學位論文 前4條

1 王宇;人參皂苷Rg3抑制人小細胞肺癌NCI-H446細胞增殖及下調caveolin-1表達作用的研究[D];大連醫(yī)科大學;2012年

2 鄭意文;虎紋蛙病毒（TFV）粒子中宿主蛋白Caveolin1的鑒定[D];中山大學;2013年

3 陳定南;沉默維生素D結合蛋白基因對膀胱癌T24細胞生物學特性的影響[D];南方醫(yī)科大學;2013年

4 盧瓊;氨氯地平對氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞荷脂過程及Caveolin-2表達的影響[D];南華大學;2012年

，

本文編號：2565210