【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種十分常見的運動神經(jīng)元退行性疾病，家族遺傳性ALS(fALS)中約有20%是由SOD1基因的遺傳突變導致的，但其具體的致病機理尚未被闡明。銅鋅超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）是生命體中主要的抗氧化酶，其功能是將O2-·自由基歧化成H2O2和O2，使細胞免受氧自由基的損傷。已有動物實驗表明SOD1催化功能的喪失并非是fALS的致病原因，目前一個被普遍接受的發(fā)病機理的理論是SOD1的突變使其獲得了一種有毒的功能，該毒性引起神經(jīng)細胞的死亡，從而導致fALS病。但是這一理論的關鍵，也就是導致fALS病的SOD1突變使該酶獲得一種新的有毒功能，還沒有在實驗上被直接證明。因此，對SOD1自身本來具有的或者突變后獲得的生物功能的研究無疑成為探究fALS致病機理的關鍵。 實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)失去了Sod1活性的酵母細胞會表現(xiàn)出不耐高溫和鈣離子敏感的缺陷，而且敲除BSD2基因能使沒有Sod1酶的酵母細胞恢復耐高溫和鈣離子平衡。據(jù)文獻報道，H+-ATP酶Pma1發(fā)生定位錯誤時也會導致相同的缺陷，這些缺陷也同樣被BSD2的敲除而消除。因此，我們推斷Sod1在Pma1的正確定位過程中起重要作用，Pma1在沒有Sod1的細胞中發(fā)生了定位錯誤，從而使細胞喪失耐高溫的能力和鈣離子失衡。本論文首先從實驗上檢驗了這一假設是否正確。 我們在酵母野生態(tài)和sod1突變株細胞中表達了Pma1-GFP嵌合蛋白，借助激光共聚焦顯微鏡來觀察的Pma1的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生態(tài)細胞的Pma1-GFP蛋白分子同文獻報道的一樣定位于細胞膜，而在sod1突變細胞中則分布在整個細胞質(zhì)空間中。這一結(jié)果表明，Pma1在沒有Sod1的細胞中確實發(fā)生了定位錯誤。此外，，我們還發(fā)現(xiàn)在sod1bsd2菌株中，Pma1和在野生態(tài)細胞中一樣正常定位在細胞膜上。這些實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)了Sod1的一個以前未知的新生物功能，同時表明缺乏Sod1引起的Pma1的定位錯誤很可能使酵母細胞喪失了耐高溫的能力和鈣離子失衡。 在獲得上述實驗結(jié)果的基礎上，我們研究了Pma1在SOD1G85R和SOD1G93A的酵母細胞中的定位。這兩個酵母細胞株表達類似于在人體中能導致fALS的Sod1的突變體G85R或者G93A。結(jié)果顯示，在SOD1G85R突變株中，30℃和39℃溫度下Pma1-GFP均錯誤定位在了細胞質(zhì)中；而在SOD1G93A突變株中，在39℃時發(fā)生了定位錯誤。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)SOD1G85R細胞過度表達Pma1-GFP時發(fā)生了嚴重的細胞形態(tài)缺陷，而這個缺陷在過度表達Can1-GFP時顯得更為嚴重。同樣實驗條件下，野生態(tài)和sod1細胞的形態(tài)都正常，沒有顯示變形。這是一個有重要意義的發(fā)現(xiàn)，因為它是首次在酵母細胞形態(tài)變化的水平上顯示與導致fALS病的相類似的G85R的Sod1突變確實獲得了一個新的有毒功能，而該功能使酵母細胞產(chǎn)生嚴重的形態(tài)缺陷。這些實驗結(jié)果也表明，酵母是研究fALS發(fā)病機理的一個很好的模型。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：TQ926;R744.8

【參考文獻】

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1 陳淮楊，劉望夷;從超氧化物歧化酶的分布和結(jié)構看其分子進化[J];生物化學與生物物理進展;1996年05期

本文編號：2550013