發(fā)布時間：2019-10-06 17:20

【摘要】：病理性疼痛使人們遭受著巨大的痛苦，據(jù)統(tǒng)計，全世界人口1/3以上遭受著持續(xù)或反復發(fā)作的疼痛折磨。在各種類型的病理性疼痛中，神經(jīng)性疼痛（neuropathic pain）被視為最難攻克的難題，它是由神經(jīng)系統(tǒng)受損或功能失調引起的病理性疼痛，是建立在神經(jīng)功能、結構和遞質傳遞改變的基礎上的。自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常性疼痛是神經(jīng)性疼痛的主要表現(xiàn)。神經(jīng)性疼痛的治療非常棘手，近年來雖然在疼痛發(fā)病機制的基礎研究方面突飛猛進，然而臨床上的治療手段仍然有限，并且治療效果并不理想。目前，，藥物治療仍然是該病治療的主要手段。因此，未來的研究熱點將是針對神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機制而進行的新型藥物開發(fā)。 已有大量研究表明，N型鈣離子通道（CaV2.2）在感覺神經(jīng)元上的功能與疼痛密切相關。由于CaV2.2的生理功能就是促進神經(jīng)遞質的釋放，它能夠調控感覺神經(jīng)元內許多不同神經(jīng)遞質的釋放，其中最感興趣的與疼痛研究有關的是降鈣素基因相關肽（CGRP）[130,296]。CGRP是一個強有力的神經(jīng)肽，它能夠引發(fā)血管舒張，并且它與疼痛和炎癥反應有關[44,398,432]。因此，這就需要開發(fā)一種新型藥物，能夠拮抗CaV2.2的功能，抑制CGRP的釋放，降低受傷動物模型超敏反應，從而起到治療CaV2.2相關性神經(jīng)性疼痛的目的。本研究以CRMP-2為中心，探討了CRMP-2與CaV2.2之間的功能相互聯(lián)系和作用機制，在研究過程中從CRMP-2上獲取了一個新型肽段——CBD3，進一步研究了CBD3與NMDARs和CaV2.2的相互作用及其機制，闡明了CRMP-2和CBD3在調節(jié)神經(jīng)遞質釋放中的作用，旨在為CaV2.2相關性神經(jīng)痛的藥物治療開辟一條新的研究途徑。 第一部分CRMP-2對CaV2.2的調節(jié)機制的研究 突觸傳遞是通過一連串的蛋白-蛋白相互作用來進行調節(jié)的，而這些蛋白間的相互作用又依賴于突觸前后鈣離子通道的本身的定位及功能。CRMP-2被確認為是CaV2.2的潛在結合伴侶。但是到目前為止，CRMP-2在突觸傳遞中的作用還沒有被研究的很透徹。 本研究目的主要是為了解決以下幾個問題：①明確CRMP-2是否與CaV2.2進行功能性的和生化性的相互作用；②CaV2.2-CRMP-2之間的相互作用是否影響CaV2.2的功能；③CRMP-2是否能夠調節(jié)突觸傳遞。 本研究通過一系列生物化學實驗方法，免疫組織化學實驗方法，神經(jīng)電生理研究方法，分子生物學實驗方法，動物行為學實驗方法等研究得出以下研究結果：（1）CRMP-2與CaV2.2共同存在于突觸和一些相同的亞細胞區(qū)室內；（2）CRMP-2與CaV2.2共同存在于一個復合物內；（3）在CRMP-2內，確定了的三個與CaV2.2發(fā)生相互作用的區(qū)域：一個位于CRMP-2的N-末端（殘基94-166），另一個位于蛋白質中部（殘基212-297），還有一個在CRMP-2蛋白質的C-末端附近（殘基479-500），鄰近微管結合域。它們分別被稱為CaV結合域（CBDs）1-3。（4）在CaV2.2上確定了兩個區(qū)域能夠與CRMP-2結合：環(huán)1（L1）和C-末端遠端部分（Ct-d）；（5）CRMP-2與CaV2.2之間的相互作用調節(jié)具有活動依賴性：即增加通過CaV2.2的鈣離子內流能夠增強CRMP-2-CaV2.2之間的相互作用，但當鈣離子流入量達到100μM左右時，隨著鈣離子濃度的繼續(xù)升高，CRMP-2與CaV2.2之間的相互作用強度就會逐漸下降；（6）CRMP-2-EGFP轉染神經(jīng)元中的鈣離子電流密度顯著高于EGFP轉染神經(jīng)元（P0.05），而CRMP-2shRNA慢病毒感染的神經(jīng)元的鈣離子電流密度與CRMP-2-EGFP過表達的神經(jīng)元相比，減少了80%（P0.05）；（7）與EGFP轉染神經(jīng)元相比，CRMP-2-EGFP轉染神經(jīng)元內有更多的CaV2.2的表面蛋白表達；（8）CRMP-2-EGFP轉染的神經(jīng)元促使的谷氨酸釋放量，與對照組中EGFP轉染的神經(jīng)元相比，提高了2.3倍（P0.05）；（9）CRMP-2S522A和CRMP-2S522D轉染的神經(jīng)元與CRMP-2-KDR WT相比，鈣離子的流入量明顯減少（P0.05）；（10）通過Cdk5的CRMP-2磷酸化導致與CRMP-2發(fā)生免疫沉淀的CaV2.2的數(shù)量明顯增加（P0.05）；（11）通過使用肽測位儀合成了一系列包含有CaV2.2結合域的長度為15個氨基酸的肽段，并從中挑選出了與CaV2.2具有最高結合潛力的一個，它就是CBD3，它能夠通過CaV2.2上L1和Ct-d與CaV2.2結合；（12）將CBD3融合到HIV蛋白質TAT的轉導域上，這就產(chǎn)生了細胞穿透性肽段TAT-CBD3；（13）TAT-CBD3通過兩種途徑影響CaV2.2，從而影響鈣離子內流：①破壞CRMP-2與CaV2.2之間的相互作用來降低CaV2.2電流，而非通過直接靶向作用于CaV2.2；②拮抗CRMP-2誘導的鈣離子通道電流增強的作用；（14）用TAT-對照培育的脊髓切片暴露于辣椒素后在iCGRP顯示出了約9倍的升高，而用TAT-CBD3培育的脊髓切片與基礎iCGRP水平相比則顯示出了少于3倍的增長（P0.05）；（15）在神經(jīng)性疼痛動物模型中，TAT-CBD3用量為0.1mg/kg時，PWT（縮足閾值）明顯下降；用量為1mg/kg時，可以完全逆轉超敏反應；用量為10mg/kg時，PWT則不再升高；（16）TAT-CBD3應用1小時或7天后，對動物進行旋轉實驗，動物在轉桿上保持直立沒有影響；（17）對應用TAT-CBD3的大鼠進行Morris水迷宮測試，大鼠在用藥后3小時、1天、2天和3天這4個時間段進行實驗，均未顯示出明顯的記憶缺陷。 主要研究結論：①CRMP-2是CaV2.2的重要調節(jié)因子：CRMP-2能夠協(xié)助轉運CaV2.2至膜，導致膜表面CaV2.2表達量增加，從而使CaV2.2電流增強；②CRMP-2的過表達能夠促進CaV2.2介導的遞質釋放；③通過Cdk5在Ser-522位點的CRMP-2磷酸化是CRMP-2調節(jié)CaV2.2功能的重要決定因素；④TAT-CBD3是一種新型的CaV2.2拮抗劑，它能夠抑制CGRP的釋放，并能降低受傷動物模型超敏反應，因此可用于治療CaV2.2相關的神經(jīng)性疼痛等疾病，且TAT-CBD3不會造成嚴重的鎮(zhèn)靜作用和運動、協(xié)調功能上的缺陷，也不影響記憶提取。 第二部分TAT-CBD3的神經(jīng)保護作用及機制的研究 通過N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDARs）的失控的鈣內流已經(jīng)與神經(jīng)毒性級聯(lián)反應的激活聯(lián)系到了一起，最終導致細胞死亡（比如興奮毒性）。CRMP-2被認為影響了NMDAR的轉運，并且有可能與興奮毒性后的神經(jīng)元存活有關�；谝陨涎芯�，提出一個假設：來自于CRMP-2的一個肽段CBD3在面對興奮毒性刺激時能夠保護神經(jīng)元。 為了確定從CRMP-2獲得的CBD3在融合了穿膜肽TAT后（TAT-CBD3）是否具有神經(jīng)保護作用及其神經(jīng)保護作用的機制，本研究通過使用與前一部分相似的科研技術手段，進行了大量的實驗研究，得出以下結果：（1）給予谷氨酸/絲氨酸刺激后，暴露在TAT-CBD3的神經(jīng)元與暴露在TAT-對照的神經(jīng)元相比，CRMP-2裂解減少約70%（P0.05）；若給予離子霉素刺激，TAT-CBD3不改變CRMP-2的裂解情況；在體外，TAT-CBD3不會改變鈣蛋白酶的活性和CRMP-2的裂解；（2）TAT-CBD3在3μM和1μM的情況下，對谷氨酸/絲氨酸產(chǎn)生的興奮性毒性的神經(jīng)保護作用明顯（P0.05）；用10μM TAT-CBD3預處理神經(jīng)元后，給予谷氨酸/絲氨酸刺激，發(fā)現(xiàn)刺激后0.5小時所表現(xiàn)的神經(jīng)保護作用具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；（3）用TAT-對照對神經(jīng)元進行預處理后，給予刺激，CRMP-2shRNA慢病毒轉導的神經(jīng)元與陰性shRNA處理的神經(jīng)元相比，細胞存活率明顯增加（p 0.05）；在轉導了CRMP-2shRNA并在興奮性毒素刺激前用TAT-CBD3預處理的神經(jīng)元中，觀察到了完全的神經(jīng)保護作用；對于轉導了陰性shRNA慢病毒的神經(jīng)元，TAT-CBD3并未顯示出完全的神經(jīng)保護作用；（4）用ω-CTX處理后，無論是用還是不用谷氨酸/絲氨酸刺激神經(jīng)元，都對CRMP-2的裂解沒有影響；ω-CTX對CaV2.2的阻斷作用沒有明顯地改變神經(jīng)元在谷氨酸/絲氨酸刺激后的存活；（5）用溶質、TAT-對照或TAT-CBD3預處理神經(jīng)元10分鐘后，給予谷氨酸/甘氨酸刺激，TAT-CBD3處理組與其他兩個組相比，其胞質內鈣離子濃度（[Ca2+]c）顯著降低（P0.05），平均曲線下面積分別減少了78%和75%（P0.05）；（6）當對神經(jīng)元使用50μM NMDA時觀測到了[Ca2+]c的尖銳增加峰，并且在移除NMDA后恢復到基線。當在NMDA三次刺激的間期使用溶質（DMSO）時，未觀察到[Ca2+]c幅度的改變。然而，當在該間期使用10μMTAT-CBD3培育神經(jīng)元時，NMDA的第二次和第三次反應大大衰減了。對于溶劑處理的神經(jīng)元，NMDA誘導的第二和第一鈣離子峰比值（P2/P1）為1.05±0.09，而10μMTAT-CBD3孵育將P2/P1比值減小到0.25±0.03。TAT-CBD3處理神經(jīng)元的第三和第一鈣離子峰(P3/P1)比值為0.33±0.03，TAT-CBD3和100μM AP-5共同使用的P2/P1比值0.19±0.03，P3/P1比值為0.93±0.08；（7）將CRMP-2siRNA+GFP轉染入5DIV的神經(jīng)元，然后使用雙脈沖NMDA方案在7DIV進行鈣成像。與未轉染的對照組相比（P2/P1=0.29±0.06），轉染了CRMP-2siRNA的神經(jīng)元顯示出TAT-CBD3對NMDAR介導的鈣離子內流抑制作用減弱（P2/P1=0.60±0.09，p 0.05）；（8）通過分別使用NR2B和NR2A的特異性阻斷劑Ifenprodil和Peaqx對皮層神經(jīng)元預處理10分鐘，然后用谷氨酸/甘氨酸刺激神經(jīng)元30分鐘，在7DIV中發(fā)現(xiàn)Ifenprodil而非Peaqx能完全阻止谷氨酸/甘氨酸誘導的毒性（P0.05）；（9）用10μM TAT-對照孵育神經(jīng)元后與溶質孵育的神經(jīng)元相比20分鐘時熒光沒有發(fā)生明顯變化。與此相反，孵育10μM TAT-CBD3引起NR2B-SEP熒光減少約60%（P0.05）；（10）在肽段/藥物使用后20分鐘觀察到，NMDAR拮抗劑MK801（50μM）和10μM的TAT-CBD3的共同應用完全阻止了TAT-CBD3誘導的NR2B-SEP熒光降低，單獨用50μM MK801處理對NR2B-SEP熒光沒有影響；（11）給予50μM NMDA刺激2秒，兩次刺激之間的時間間隔為30秒。在5分鐘穩(wěn)定的NMDA刺激反應（峰值變化5%）后，向神經(jīng)元灌注10μM TAT-CBD3。TAT-CBD3誘導快速強烈的NMDA電流的抑制作用，并在5分鐘后阻斷約~70%。使用無TAT-CBD3的電解液沖洗，在10分鐘后部分NMDA電流恢復。 主要研究結論：①TAT-CBD3通過減少谷氨酸刺激下的鈣離子內流，阻止α-血影蛋白和CRMP-2的鈣蛋白酶裂解；②CRMP-2基因沉默本身具有神經(jīng)保護作用，它不止和谷氨酸介導的神經(jīng)毒性有關，還能有效的針對性的阻止興奮性毒性介導的神經(jīng)元死亡；③TAT-CBD3是一種新型神經(jīng)保護肽，可通過抑制NMDARs和誘導樹突棘NMDAR內在化，最終導致谷氨酸誘導的DCD和NMDA刺激的鈣離子內流減少，從而有效的治療慢性神經(jīng)性疼痛以及卒中或其他神經(jīng)性損害后的興奮性毒性。
【圖文】：

圖 1.2 CRMP-2 的晶體結構Figure 1.2 Crystal structure of CRMP-2(A) 在 1.90 時四聚體化的 CRMP-2 的晶體結構。四聚體化的 CRMP-2（14-490）在鎂離子存時可以被晶體化。為了清楚描述，每個單體都涂上了不同的顏色。 (B) CRMP-2 來自圖 A 中同一晶體結構的 CRMP-2 單體。黃色序列代表 CRMP-2 的 C-末端區(qū)域（484-490），這個序列將在論文被討論。大體結構的時候，這個假設被證實了（圖 1.2）[424]。在這個結構中，大多數(shù) CRMP-2被包裝好的，盡管殘基 491-572 被預測是不穩(wěn)定的，并且沒有包含在這個結構中。RMP-2 的結晶化需要二價金屬的存在（比如說鈣離子和鎂離子）。這個需求最可能是因于被這些金屬離子誘發(fā)的 CRMP-2 的四聚體化[297,424]。盡管早些的研究都是關于RMP-2 和其四聚體結構的，但是我們關于如何將四聚體結構聯(lián)系到 CRMP-2 的功能上知道的很少，然而一個研究觀察到鈣調蛋白幾乎特異性地結合于 CRMP-2 的單體形式516]。目前，還不知道是否其他的蛋白優(yōu)先地結合于這個或另外一個形態(tài)。然而，通常設，因為 CRMP-2 作為四聚體而被結晶化，并且當從腦部分離時發(fā)現(xiàn)其就是一個四聚，所以四聚體最有可能是它本身的結構。

圖 1.3 NMDARs: 亞單位的組成及化學計量學e 1.3 NMDARs: subunit composition and stoichi NR1 和兩個 NR2 亞單位組成的四聚體。這些亞單位生化復合物的細胞內 C-末端。并且還在示意圖上描述設正常細胞內/外陽離子濃度下的陽離子滲透。動劑和拮抗劑DARs 抑制因子，被開發(fā)用在科研實驗室以及用的作用一致，NMDARs 通過 L-谷氨酸和 L-天被 NMDA 激活，而 NMDA 沒有激活其他的離子在靜息膜電位時通過鎂離子被內源性的阻斷[339] NMDARs 電壓門控特性，其中，強烈的去極允許其他的陽離子通過通道孔隙進行移動。雖然K-801和AP-5 對大部分研究這些受體的實驗室通過結合到并封堵 NMDAR 的開放孔洞而抑制
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741


本文編號：2545849