【摘要】：目的研究purα蛋白對鋰-匹羅卡品致癇大鼠行為學、神經(jīng)元凋亡及認知功能的影響,探討purα對癲癇發(fā)生的預防作用及機制。材料和方法實驗動物的選擇經(jīng)寧夏醫(yī)科大學倫理委員會批準,按照相應動物實驗操作準則進行。選擇雄性Sparague-Dawley(SD)大鼠。挑選標準為:成年大鼠,6~8周,體重在200~250g之間。飼養(yǎng)條件:避光,適宜的溫度和濕度24小時晝夜循環(huán)。90只SD大鼠隨機分為Purα過表達組、沉默組、對照組共三組,每組30只。每組隨機選取大鼠,以40mg/kg體重標準腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液進行麻醉。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜,確定大鼠海馬CA1區(qū)(前囟后3.6mm,旁開2.2mm,深度2.5mm),用微量注射器緩慢推注4μL慢病毒懸液(5×108TU病毒顆粒)。對照組按上述同樣方法和坐標,注射同等體積生理鹽水完成手術過程。手術完畢后將大鼠放回籠內(nèi)單獨飼養(yǎng)且連續(xù)2天給予腹腔注射青霉素5萬U/d防止感染。注射病毒二周后每組隨機選取10只大鼠斷頭取腦,剝離出海馬組織,通過和Western Blotting證實Purα慢病毒已經(jīng)在海馬組織表達;其余每組20只大鼠用匹羅卡品誘導癲癇;根據(jù)Racine評分標準為依據(jù)來判定癲癇發(fā)作級別,若癲癇發(fā)作達到Ⅲ~Ⅴ級則視為成功。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作沒有達到Ⅲ級則按要求每30min增加注射一次匹羅卡品,增加劑量為10mg/kg,補充的總注射次數(shù)最多不超過3次。癲癇發(fā)作1小時后觀察記錄大鼠的行為學變化,癲癇發(fā)作3d后每組選取10只大鼠進行水迷宮實驗,實驗設計共5天,可分為空間搜索實驗及定位巡航實驗兩部分。巡航實驗記錄4天(4次/d),觀察各組大鼠的空間學習能力。第5天進行空間搜索實驗,記錄大鼠在規(guī)定時間內(nèi)穿越平臺象限的次數(shù)及停留時間,作為判斷大鼠空間記憶能力參考指標。其余每組大鼠進行實驗取材,一部分斷頭剝離腦組織取海馬CA1區(qū)組織進行凍存;一部分大鼠行活體灌注取材石蠟包埋;取材進行免疫組織化學檢測Caspase-3表達水平;通過Western-Blot及免疫組織化學檢測海馬神經(jīng)元caspase-3的表達變化水平。統(tǒng)計分析使用spss20.0軟件比較分析,實驗數(shù)據(jù)以x士s來表示。用單因素方差分析(one-wayanova)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計比較,組間比較采用lsd法,當各組的方差不齊時用dunnett法進行均數(shù)間的兩兩比較。實驗結(jié)果以p0.05為有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果1.morris水迷宮實驗:purα沉默組癲癇大鼠與其他兩組相比較,逃避潛伏期時間長,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。purα過表達癲癇組與癲癇模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。隨著實驗天數(shù)的增加,各組逃避潛伏期也逐漸呈縮短趨勢,purα過表達癲癇組大鼠與其他兩組相比較,縮短趨勢并不明顯。平臺象限滯留時間三組之間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。平臺象限穿越次數(shù),purα過表達癲癇組大鼠與沉默組相比較差異有統(tǒng)計學意義,與癲癇模型組相比差異則無統(tǒng)計學意義。2.purα蛋白在海馬區(qū)域的表達:海馬ca1區(qū)注射高滴度的purα慢病毒顆粒2周后,提取海馬組織蛋白,免疫印跡結(jié)果顯示purα蛋白表達量在purα過表達組表達明顯增高,沉默組則明顯降低;三組之間比較,差異具有統(tǒng)計學意義,說明purɑ慢病毒對海馬組織進行基因?qū)哟紊系母深A是成功的。3.癲癇大鼠海馬ca1區(qū)he染色結(jié)果癲癇誘導成功三天后,海馬形態(tài)及病理改變。癲癇模型組細胞排列規(guī)則,細胞結(jié)構欠完整。purα過表達組,細胞排列緊密,結(jié)構相對完整清晰,染色質(zhì)均勻分布。沉默組,細胞結(jié)構紊亂,神經(jīng)元變性壞死,間距加大,存在明顯神經(jīng)元凋亡。4.免疫組織化學染色:匹羅卡品誘導大鼠癲癇發(fā)作3d后,與癲癇模型組和沉默組相比,purα過表達組偶見棕染細胞、著色較淺;癲癇模型組陽性細胞較過表達組多;沉默組,可見大量陽性細胞,其胞漿和胞核內(nèi)均有棕黃色或棕褐色顆粒沉著。說明purα對癲癇發(fā)作所導致的海馬神經(jīng)元有保護作用,沉默purα基因的表達,可使得癲癇誘導的神經(jīng)元凋亡加重。5.western-blot:caspase-3的表達水平,各組大鼠海馬中caspase-3均有表達,與癲癇模型組和過表達組相比較,沉默組表達明顯增高。癲癇模型組與過表達組相比(p0.05)。過表達與沉默組相比(p0.01)。這一結(jié)果與免疫組織化學觀察到的結(jié)果是吻合的,說明Purα能夠減輕癲癇導致的細胞凋亡。結(jié)論purα能減輕因癲癇發(fā)作導致的DNA損傷,對致癇大鼠海馬神經(jīng)元有保護作用。
【圖文】：

圖 1A 為大鼠限停留時間；1B 為平臺象限穿越次數(shù)；a,b 與沉默組相比，（aP<0.01表 1 大鼠水迷宮實驗數(shù)據(jù)的比較（x ±s）逃避潛伏期（s）停留時間(s第 1d 第 2d 第 3d 第 4d

正常組相比#p<0.05；與沉默組相比*p<0.01；A-1，A-2，A-3 分別為過表達圖 2 Purɑ慢病毒在海馬區(qū)域中的表達. Purɑ慢病毒對癲癇大鼠行為學的影響根據(jù) Racine 評分判定癲癇發(fā)作級別：0 級無驚厥；一級可見大
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡愛蓮;匹羅卡品對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的毒性作用[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;1999年06期

2 周權,樓洪剛;匹羅卡品漱口液的制備及質(zhì)量考察[J];華西藥學雜志;2001年04期

3 胡勇平,張惠成,鄭超一;匹羅卡品脂質(zhì)體與凝膠縮瞳作用的實驗研究[J];中國現(xiàn)代應用藥學;2003年04期

4 李灝;徐安定;廖衛(wèi)平;易詠紅;孫衛(wèi)文;;內(nèi)皮素受體拮抗劑對匹羅卡品誘導大鼠急性癲癇發(fā)作的影響[J];暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版);2010年02期

5 高揚;;匹羅卡品水劑與油劑降眼壓作用比較[J];基層醫(yī)刊;1982年04期

6 賀忠江;體位-匹羅卡品試驗及其臨床意義[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;1984年03期

7 蘇燕生;匹羅卡品眼科制劑的穩(wěn)定性研究[J];山東醫(yī)藥工業(yè);1997年03期

8 虎安全;;加有緩沖劑的硝酸匹羅卡品滴眼劑不宜用中和法測定含量[J];中國藥學雜志;1989年09期

9 李銳,杜芳,陳云春,黃遠桂;代謝型谷氨酸受體亞型1基因在鋰—匹羅卡品致癇大鼠齒狀回中的長期高表達[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2003年04期

10 Kriechbaum K.;Findl O.;Koeppl C. ;宋虎平;;人工晶體生物測定變化:刺激驅(qū)動還是匹羅卡品誘導[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘.眼科學分冊;2005年07期

相關會議論文 前10條

1 來海歐;楊金升;石向群;杜旭輝;閆俊強;;氯化鋰-匹羅卡品致癲癇動物模型藥物劑量比較與分析[A];第十一屆全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2008年

2 易芳;穆他森;龍莉莉;李藝;李蜀渝;吳志國;肖波;;匹羅卡品致癇大鼠慢性期海馬神經(jīng)元的突觸重建研究[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2010年

3 李莉燕;;1%匹羅卡品眼藥水棉片放置降眼壓法[A];首屆《中華護理雜志》論文寫作知識專題講座暨研討會論文匯編[C];2001年

4 肖波;龍莉莉;易芳;陳鍶;畢方方;吳志國;;匹羅卡品致癇大鼠海馬GABA能中間神經(jīng)元數(shù)目變化及其軸突出芽的研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2008年

5 李偉;蔣春明;李婷婷;李光乾;;發(fā)育鼠匹羅卡品致癇模型的建立及黃芩甙對模型鼠行為改變的影響[A];2008年浙江省兒科學學術年會論文匯編[C];2008年

6 來海歐;楊金升;石向群;王娟;安敏;;艾芬地爾干預氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠的急性期腦電圖特征[A];第十一屆全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2008年

7 梁益;孫紅斌;;大鼠氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型致癇機制研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2008年

8 張莉;徐利軍;池志宏;于丹;王占友;;鋰-匹羅卡品致顳葉癲癇小鼠模型的建立及苔蘚纖維出芽的實驗研究[A];2007年中國解剖學會第十屆全國組織學與胚胎學青年學術研討會論文摘要匯編[C];2007年

9 余倩;李成;;小劑量反復注射匹羅卡品建立顳葉癲癇大鼠模型的研究[A];貴州省第六屆中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)科學術年會論文匯編[C];2013年

10 李新民;陳會;任艷艷;路巖莉;;熄風膠囊對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠皮層和海馬多藥耐藥相關蛋白1表達的研究[A];第28次全國中醫(yī)兒科學術大會暨2011年名老中醫(yī)治療（兒科）疑難病臨床經(jīng)驗高級專修班論文匯編[C];2011年

相關重要報紙文章 前1條

1 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 張中橋;電針治癲癇有實驗依據(jù)[N];健康報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 馬帥;氯化鋰—匹羅卡品致癇慢性癲癇大鼠海馬區(qū)腦白質(zhì)損傷的初步研究[D];復旦大學;2014年

2 Mutasem Abuhamed;匹羅卡品致癇大鼠海馬鈣視網(wǎng)膜蛋白、微清蛋白性中間神經(jīng)元的動態(tài)變化及其突觸聯(lián)系[D];中南大學;2010年

3 徐婧婧;Ghrelin對匹羅卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用[D];山東大學;2009年

4 張勇;粒細胞集落刺激因子在鋰－匹羅卡品致vN大鼠模型中的神經(jīng)元保護作用[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

5 李杰;Dock3在癲癇發(fā)作中的作用及其可能的機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

6 池志宏;鋅離子及ZNT3在匹羅卡品癲癇模型小鼠海馬分布和表達的研究[D];中國醫(yī)科大學;2008年

7 劉永紅;D-serine在匹羅卡品致vN小鼠腦GABA能神經(jīng)元變性中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

8 吳偉;鈣離子相關機制在慢性顳葉癲癇發(fā)生中作用機制的實驗研究[D];山東大學;2005年

9 張玉皎;Plic-1在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

10 陳云春;實驗性癲癇海馬神經(jīng)發(fā)生與癲癇發(fā)生相關性的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

相關碩士學位論文 前10條

1 吳旭玲;Pumilio-2在難治性癲癇患者及匹羅卡品致癇大鼠腦組織中的表達研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

2 谷娟;耐藥性vr癇中cGKII的表達及作用機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

3 賈俊偉;Annexin A7在癲癇小鼠腦組織中的表達及對神經(jīng)元興奮性的影響[D];山東大學;2016年

4 鐘琴;低頻經(jīng)顱磁刺激對匹羅卡品致癇小鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生的抑制作用[D];長江大學;2016年

5 熊艷;磷脂酰肌醇聚糖-4在癲癇患者及癲癇動物腦部的表達及其對癇性發(fā)作的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

6 楊征;Purα蛋白對鋰—匹羅卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及學習記憶的影響[D];寧夏醫(yī)科大學;2016年

7 Alsharafi Walid（阿里）;匹羅卡品致癇小鼠模型海馬神經(jīng)元中熱休克蛋白22的神經(jīng)保護作用[D];中南大學;2012年

8 王勝軍;微管相關蛋白2與匹羅卡品致癇大鼠海馬結(jié)構重建的實驗研究[D];山東大學;2005年

9 李灝;內(nèi)皮素在匹羅卡品致癇大鼠癲癇發(fā)作及海馬硬化中的作用[D];暨南大學;2010年

10 呂曉明;鋰—匹羅卡品致癇幼鼠海馬結(jié)構損傷的形態(tài)學及苔蘚纖維發(fā)芽研究[D];中國醫(yī)科大學;2002年

，

本文編號：2520043