【摘要】：DJ-1/PARK7（Parkinson protein7）基因的缺失或突變，是引起的常染色體隱性早發(fā)性帕金森病（Parkinson's disease，PD）一個(gè)重要的原因。然而，DJ-1突變體誘發(fā)帕金森病的原因仍未被人們了解。β-Syn突變?cè)诩?xì)胞內(nèi)形成包涵體，加速神經(jīng)細(xì)胞退化。在誘導(dǎo)細(xì)胞變性的過程中DJ-1與β-Syn突變體之間的聯(lián)系與自噬關(guān)系還不清楚。所以我們的研究旨在穩(wěn)定表達(dá)β-Syn P123H的239T細(xì)胞中研究P123H與DJ-1突變體的相互作用以及對(duì)神經(jīng)退化的影響。 本實(shí)驗(yàn)首先通過PCR構(gòu)建DJ-1野生型（DJ-1WT）與兩步PCR構(gòu)建突變體的方法構(gòu)建L166P、D149A、A104T三個(gè)突變型的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過質(zhì)粒全長測序確定序列的正確性。使用帶有潮霉素抗性標(biāo)記的β-Syn P123H質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用推薦劑量200μg/mL的Hygromycin B（潮霉素B）建立抗性篩選的β-Syn P123H穩(wěn)定表達(dá)293T細(xì)胞模型。并在建立的β-Syn P123H突觸核蛋白細(xì)胞的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染DJ-1野生型與DJ-1突變型質(zhì)粒。 其次，為確定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達(dá)情況，使用免疫印跡以及免疫熒光標(biāo)記，分別檢測DJ-1的標(biāo)簽蛋白C-Myc與β-Syn P123H，使用Real-time PCR檢測293T細(xì)胞模型內(nèi)DJ-1與β-Syn mRNA的水平，確定細(xì)胞模型構(gòu)建成功。 通過對(duì)線粒體的熒光標(biāo)記，加入FCCP帶來氧化應(yīng)激的刺激，測定細(xì)胞模型線粒體對(duì)于氧化應(yīng)激的應(yīng)答水平。通過細(xì)胞的WST-1活性分析，乳酸脫氫酶（LDH）的釋放測定細(xì)胞模型的活性，檢測DJ-1與β-Syn P123H對(duì)于細(xì)胞的毒性影響。 最后通過溶酶體的標(biāo)記Marker測定β-Syn P123H與DJ-1和溶酶體的關(guān)系。研究Atg-5、Becline-1、LC3三種哺乳動(dòng)物的自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況。檢測mTOR通路上的mTOR、p70-S6K、4E-BP1的磷酸化水平。使用自噬溶酶體和蛋白酶體的抑制劑確定β-Syn P123H以及重組的DJ-1蛋白的降解途徑以及作用方式。通過TUNEL測定β-SynP123H細(xì)胞的凋亡水平。 結(jié)論：穩(wěn)定高表達(dá)β-Syn P123H蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集，通過自噬溶酶體途徑降解。β-SynP123H與FCCP一樣對(duì)線粒體產(chǎn)生去極化，DJ-1WT可以挽救線粒體去極化現(xiàn)象，緩解β-Syn P123H的細(xì)胞毒性，而DJ-1突變體則加重細(xì)胞毒性。野生型的DJ-1彌散分布在細(xì)胞內(nèi)，通過自噬溶酶體途徑與β-Syn P123H產(chǎn)生相互作用，促進(jìn)β-Syn P123H降解。突變DJ-1在線粒體聚集，誘導(dǎo)蛋白自噬障礙，β-Syn P123H在胞內(nèi)聚集增多加速神經(jīng)退化和自噬性細(xì)胞死亡。
【圖文】：

4 結(jié)果與討論構(gòu)建、鑒定以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系in 重組質(zhì)粒構(gòu)建生型 DJ-1 WT 與 DJ-1 突變體的全A 作為重組質(zhì)粒的骨架，使用 T4 連49A、DJ-1A104T 全長于 Hind III 與 C-Myc 與 6×His 的標(biāo)簽，原核篩選抗e（Neo），，重組質(zhì)粒在 E.coil 大腸桿篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性大腸桿菌Marker 1 2 3 4Marker

圖 4-2：DJ-1 重組質(zhì)粒測序圖譜突變位點(diǎn)與野生型對(duì)照，L166P中CCT 亮氨酸突變?yōu)镃CT 脯氨酸，D149A中GAC 丙氨酸，A104T 中 GCC 丙氨酸變?yōu)?ACC 蘇氨酸）圖 4-3：DJ-1，α-Syn WT，β-Syn WT 與 β-Syn P123H 質(zhì)粒主要結(jié)構(gòu)基因連接在 pcDNA3.1(-)/myc-HisA 質(zhì)粒, Synuclein 連接在 pCEP4 質(zhì)粒）為 DJ-1 突變體與野生型序列的測序?qū)Ρ惹闆r，方框內(nèi)的基因位點(diǎn)經(jīng)過
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2516705